棉花生殖發(fā)育相關基因簇的結構和功能分析.pdf

1、棉花是具有戰(zhàn)略意義的農作物，如何提高棉花產量、改善棉花品質，歷來受到了研究者的高度重視。由于棉花的經濟價值主要通過其生殖器官的發(fā)育好壞體現，因此對其生殖發(fā)育進行深入研究，將是實現培育高產優(yōu)質棉花的重要突破口。 本論文根據以往的研究，推斷在緊密連鎖且同在生殖器官中特異表達的arf1和nodulin-like基因附近存在著一個與生殖發(fā)育相關的基因簇。從這一推斷著手，開展了相應的研究，以期能夠深入認識棉花的生殖發(fā)育機理，為高產優(yōu)質棉花

2、的培育提供堅實的理論依據和物質基礎。 首先，根據已知的arf1和nodulin-like基因設計了三對PCR引物，通過PCR池篩法對棉花18RBAC文庫進行了篩選，獲得了兩個包含這兩個基因的BAC克隆G2-J-15和G128-K-15，通過酶切鑒定其插入片段大小分別為38kb和90kb。選取了插入片段較小的G2-J-15進行了全序列測序。 通過對G2-J-15的全序列測序和相關生物信息學分析發(fā)現，在短短的38kb序列中一

3、共分布了7個基因，平均每5kb就存在一個基因，說明該基因簇位于基因富集區(qū)。除了已知的arf1和nodulin-like基因外，通過基因結構預測和BLAST，還發(fā)現了未在棉花中克隆過的GhGolS(肌醇半乳糖苷合酶基因)、GhAPm(AP復合體μ亞基基因)、GhPsbP(PSⅡ放氧復合體外周蛋白基因)和GhNeuF(中性β-呋喃果糖苷酶基因)，此外，還發(fā)現了一個未在任何物種中發(fā)現過的未知基因。對這5個新基因進行了一系列的生物信息學分析，了

4、解了它們的基因結構，對蛋白質的性質、結構和功能也有了一定的了解。對這些基因進行生物信息學分析，發(fā)現了一個非常有趣的現象，即GhGolS、GhAPm和GhNeuF在棉花基因組中的排列順序和方向與其在擬南芥中同源基因的排列順序和方向一模一樣，甚至棉花GhAPm和GhNeuF基因之間間隔了兩個基因，而擬南芥中與之同源的基因之間同樣間隔了兩個基因。該基因簇在結構上異常的保守性預示著該基因簇的功能可能也非常保守，對棉花的生長發(fā)育起著至關重要的作用

5、。 利用real-timePCR對這5個棉花中新發(fā)現的基因進行了時空表達研究，建立了各基因的時空表達模型。結果發(fā)現除GhPsbP基因由于是棉花PSⅡOEC的外周蛋白而在葉片中特異表達以外，其它四個基因都在棉花生殖相關組織中特異表達：GhGolS基因在花藥和35dpa棉纖維中特異表達，GhAPm基因在30dpa棉纖維中呈優(yōu)勢表達，未知基因在花藥中的表達量最高，GhNeuF基因在花藥和25dpa棉纖維中的表達量最高。結合以前arf1

6、和nodulin-like基因在棉花生殖器官中特異表達的研究結果，證實了該區(qū)域所存在的由7個基因組成的緊密功能基因簇正如前面所推論的那樣與棉花生殖發(fā)育相關。 通過反轉錄PCR克隆得到了GhGolS和GhAPm的cDNA，其全長分別為1816和1590bp。GhGolS前面的基因結構預測結果除了錯將一段90bp的外顯子預測為內含子外，其結果與GhGolS的cDNA基本一致，GhAPm的基因結構預測結果則和其cDNA克隆完全一致。

7、 針對GhGolS和未知基因構建了過表達載體，構建了沉默棉花GhGolS和未知基因的RNAi載體，構建了沉默擬南芥AtGolS2和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi載體，構建了同時沉默擬南芥針AtGolS2、AP復合體μ亞基基因和中性β-呋喃果糖苷酶基因的RNAi載體，將其分別轉化棉花和擬南芥，獲得了擬南芥的T1代轉基因植株的種子，而針對T0代轉基因棉花的篩選也在進行。各類轉基因植株的獲得為對該基因簇進行深入研究，了解其在棉花生殖