輔助性T細胞亞群在EAE小鼠早期視神經炎發(fā)病中的作用及β-欖香烯干預的實驗研究.pdf

1、視神經炎(optic neuritis,ON)是神經眼科臨床最常見的疾病之一,是累及視神經的急性或亞急性炎癥,原發(fā)性或特發(fā)性脫髓鞘性視神經炎(idiopathicdemyelinated optic neuritis,IDON)是臨床最為常見的類型,該類型的視神經炎和MS的發(fā)病密切相關,二者有共同的病理改變。流行病學研究表明70％的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)病人存在視神經炎,10-20％的MS病人臨床首發(fā)癥

2、狀為視神經炎。特發(fā)性脫髓鞘性視神經炎的發(fā)病和MS一樣呈逐年上升趨勢,其治療現(xiàn)狀不容樂觀。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental allergicencephalomyelitis,EAE)動物模是研究MS發(fā)病機制及治療最理想的動物模型。β-欖香烯是我國自行開發(fā)研制的國家二類非細胞毒性抗腫瘤藥物,具有免疫調節(jié)的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)欖香烯對多種腫瘤有確切的療效,并且易于通過血腦屏障。鑒于ON的病理機制可能涉及與腫瘤相似的免疫調節(jié)紊

3、亂,因此本研究通過髓鞘少突膠質細胞糖蛋白多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide35-55,MOG35-55)誘發(fā)的EAE小鼠模型來探索ON發(fā)病的神經免疫學機制及β-欖香烯的神經保護作用機制,為視神經炎的基礎研究和臨床視神經炎的治療提供新的方法和實驗依據(jù)。
　　 第一部分，MOGEAE小鼠早期視神經的病理學改變及及軸索損傷的研究
　　 目的：
　　 采用公認的M

4、OG35-55誘發(fā)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型,觀察EAE小鼠視神經早期病理學變化,為脫髓鞘性視神經炎的研究建立實驗平臺。
　　 方法：
　　 使用人工合成的MOG35-55多肽在百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)和完全福氏佐劑(complete Fretmd’s Adjuvant,CFA)輔助下免疫雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,觀察模型的行為學變化(體重和臨床評分)、組織學變化

5、(蘇木素-伊紅染色、透射電鏡)和免疫組織化學變化。
　　 結果：
　　 1、行為學改變:免疫后14天左右,小鼠逐漸出現(xiàn)運動功能障礙,評分開始上升,在觀察期內,小鼠體重總體趨勢向上,臨床癥狀明顯時,體重也隨之波動出現(xiàn)小幅下降。
　　 2、形態(tài)學改變:免疫后7天、11天、15天、19天小鼠視神經逐漸出現(xiàn)明顯的炎癥反應及軸索髓鞘的不同程度的損傷。
　　 3、免疫組織化學的改變:免疫后7天小鼠可見視神經軸索損傷(

6、β-APP蛋白表達,與對照組比較,p<0.05),免疫后11天β-APP蛋白表達明顯(與對照組比較,p<0.05),免疫后11天可見視神經髓鞘損傷(CNPase蛋白表達減少,與對照組比較,p<0.05),免疫后15天CNPase蛋白表達明顯減少(與對照組比較,p<0.05),發(fā)病高峰期可見明顯的軸索髓鞘損傷(與對照組比較均p<0.05)。
　　 第二部分，MOGEAE小鼠早期視神經輔助性T細胞因子及其轉錄因子的表達時程
　

7、　 目的：
　　 研究輔助性T細胞亞群Th1、Th2、Treg、Th17特異性細胞因子其轉錄因子在脫髓鞘性視神經炎早期發(fā)病中的表達時程,以明確EAE小鼠脫髓鞘性視神經炎的免疫反應啟動及免疫炎癥維持機制。
　　 方法：
　　 通過ELISA、免疫組化及ReaL-time PCR技術觀察不同時點(免疫后7天、11天、15天、19天)視神經輔助性T細胞亞群Th1、Th2、Treg、Th17特異性細胞因子其轉錄因子的蛋

8、白及mRNA表達。
　　 結果：
　　 1、ELISA檢測:小鼠視神經內IL-17蛋白含量在免疫后11天明顯增高(與對照組比較,p<0.05)；視神經內IFN-γ蛋白含量在免疫后19天增高明顯(與對照組比較,p<0.05)；視神經內IL-4蛋白含量在免疫后19天明顯下降(與對照組比較,p<0.05)。
　　 2、免疫組織檢測:小鼠視神經FOXP3蛋白在免疫后11天表達明顯下降,持續(xù)至免疫后19天(與對照組比較,p

9、<0.05)。
　　 3、分子生物學檢測:小鼠視神經IL-17與IFN-γ的mRNA表達及轉錄因子RORγt與T-beta mRNA的表達與其蛋白表達時點一致(與對照組比較,p<0.05),FOXP3mRNA的表達在免疫后11天出現(xiàn)轉錄下降(與對照組比較,p<0.05),GATA3mRNA在免疫后19天下降明顯(與對照組比較,p<0.05)。
　　 第三部分，β-欖香烯對M OGEAE小鼠早期視神經炎的神經保護作用及干預

10、靶點
　　 目的：
　　 研究β-欖香烯對MOGEAE小鼠視神經炎軸索損傷的神經保護作用；明確β-欖香烯如何通過對輔助性T細胞亞群的分化調節(jié)及其特異性細胞因子的轉錄調節(jié)實現(xiàn)其神經保護作用,為脫髓鞘性視神經炎的治療提供新的方法和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 通過行為學、組織形態(tài)學及免疫組織化學技術觀察β-欖香烯對EAE小鼠脫髓鞘性視神經炎的神經保護作用,進一步通過分子生物學技術觀察β-欖香烯對輔助性T細胞

11、亞群特異性細胞因子的轉錄因子及調節(jié)因子的mRNA的表達影響。
　　 結果：
　　 1、行為學改變:β-欖香烯能改善EAE小鼠的神經功能評分(與對照組比較,p<0.05)。
　　 2、組織形態(tài)學改變:β-欖香烯能減輕EAE小鼠軸索及髓鞘損傷。
　　 3、免疫組織化學改變:β-欖香烯可減少EAE小鼠β-APP蛋白表達及增加CNPase蛋白表達(與對照組比較,p<0.05),減輕軸索及髓鞘損傷。
　　

12、4、分子生物學改變:免疫后11天,β-欖香烯可減少EAE小鼠視神經細胞因子IL-17、轉錄因子RORγt、分化調節(jié)因子IL-6、及IL-23p19的mRNA的表達(與對照組比較,p<0.05)；同時增加FOXP3、Socs3mRNA的表達(與對照組比較,p<0.05)。免疫后19天,β-欖香烯可減少EAE小鼠視神經細胞因子IFN-γ、轉錄因子T-beta、分化調節(jié)因子IL-12p35的mRNA的表達(與對照組比較,p<0.05)；同時增

13、加GATA3mRNA的表達,并維持FOXP3mRNA的較高水平表達(與對照組比較,p<0.05)。
　　 結論：
　　 1、MOG EAE小鼠模型早期視神經可見軸索及髓鞘損傷,且軸索損傷并非完全繼發(fā)于脫髓鞘損傷。
　　 2、Th17亞群在脫髓鞘性視神經炎的早期始動了特異性的免疫應答,Th1亞群在維持特異性免疫應答過程中發(fā)揮重要作用,Treg亞群不僅在發(fā)病早期抑制異常的免疫應答,而且在發(fā)病的高峰期同Th2亞群共同負