抗甲丸抗血管生成效應觀察及對甲狀腺腫大鼠甲狀腺細胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、甲狀腺腫，即良性的甲狀腺體積增大，是臨床常見病，在人口中的發(fā)病率達到10％以上，臨床上可分為毒性甲狀腺腫、結節(jié)性甲狀腺腫、單純性甲狀腺腫等類型。多種環(huán)境因素，如碘缺乏、碘過量、吸煙、感染、某些蔬菜等都會導致甲狀腺腫的發(fā)生。此外，多個研究證實遺傳因素在甲狀腺腫的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。通過對甲狀腺腫的家系和孿生子研究，多個與甲狀腺腫有關的基因，如甲狀腺球蛋白、鈉碘轉運體、甲狀腺過氧化物酶、TSH受體等的異常相繼被發(fā)現。甲狀腺腫的發(fā)生還與

2、人體自身因素，如免疫、感染、性別等有關。甲狀腺腫的發(fā)病機制非常復雜，血管生成、細胞凋亡和細胞增殖的異常共同參與了甲狀腺腫的形成過程。 血管生成在甲狀腺腫的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。血管生成是指由原有血管出芽生長形成新生血管的過程。血管生成與腫瘤、肥胖、類風濕、銀屑病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞后和糖尿病等關系密切。多種活性物質可調節(jié)血管生成，其中VEGF、FGF和IGF-1起著關鍵的作用。研究發(fā)現腫大的甲狀腺組織中，微血管密度明顯增加

3、，內皮細胞增殖明顯增強。VEGF和FGF在甲狀腺內可以由濾泡細胞合成，能通過旁分泌作用刺激其受體，在甲狀腺腫時VEGF和FGF表達明顯增強，可刺激甲狀腺內血管內皮細胞增殖，促進血管形成。IGF-1不但是非常重要的細胞生長因子，而且可以上調甲狀腺濾泡細胞VEGF的表達，促進血管生成，以便為增生的組織提供充足的營養(yǎng)和氧氣。進一步的研究發(fā)現TSH-TSHR信號通路激活后可以上調IGF-1和VEGF的表達促進血管生成，而TSH-TSHR通路則在

4、甲狀腺腫形成中發(fā)揮著關鍵作用。 從細胞生物學的角度，甲狀腺腫是甲狀腺細胞凋亡和增殖失衡，凋亡相對不足的結果。凋亡，即程序性細胞死亡，其過程受到細胞的精確調節(jié)。凋亡信號主要有內外兩條信號傳導通路。外源性信號通路主要由細胞表面的死亡受體與其相應的配體結合后，傳導信號至細胞內，導致凋亡的發(fā)生。內源性通路由線粒體介導，線粒體外膜穿孔導致細胞色素C釋放，從而啟動凋亡過程。大量的臨床和實驗研究表明甲狀腺腫存在凋亡信號和調節(jié)的異常。已證實在F

5、as存在于甲狀腺細胞膜上，Fas的激活可以誘導甲狀腺細胞的凋亡，在甲狀腺腫時甲狀腺細胞膜上的Fas表達減少。在大鼠甲狀腺腫模型上的研究表明Fas的數量與凋亡成正相關，在甲狀腺腫得到恢復時表達明顯增強。Bcl－2是一種對細胞凋亡有明顯抑制作用的原癌基因，能夠抑制許多因素引起的細胞凋亡。Bcl-2在正常甲狀腺細胞表達，在毒性甲狀腺腫、藥物誘導的甲狀腺腫模型上表達顯著增加，伴隨著甲狀腺腫的消退，其表達量也減少。 甲狀腺腫的發(fā)生同時也是

6、甲狀腺細胞增殖過度的結果。TSH-TSHR信號通路是刺激甲狀腺細胞增殖的關鍵。當甲狀腺激素的合成出現障礙，甲狀腺激素水平的下降通過負反饋調節(jié)促進垂體釋放TSH，升高的TSH促進甲狀腺細胞增殖造成甲狀腺腫大，已為眾多實驗證實。對于單純性甲狀腺腫和結節(jié)性甲狀腺腫而言，患者體內的甲狀腺激素和TSH水平并沒有明顯變化，一般認為是甲狀腺細胞對TSH的敏感性增強所致。GraveS病是導致毒性甲狀腺腫的主要因素，其機制是通過自身刺激性抗體與TSH受體

7、結合，模擬TSH的效應，促進甲狀腺細胞增殖形成甲狀腺腫。近年來的研究還揭示出在TRS-TSHR信號傳導通路之外，存在著可以促進甲狀腺細胞增殖的多種信號分子，如IGF-1、HGF等。多個研究表明IGF-1在甲狀腺腫的發(fā)生中起重要作用。 一直以來，甲狀腺腫的治療主要有三種方法：甲狀腺激素、手術和[3]碘放射性治療。臨床上這三種方法各有其并發(fā)癥和副作用，例如甲狀腺腫大的復發(fā)、骨量丟失、甲狀腺功能減退及對心血管的不良影響等。因此，有必要

8、探索新的副作用更少的治療方法。中醫(yī)藥在中國已有兩千多年的歷史，并且正逐步走向世界，因其好的療效、極少的副作用日益受到歡迎?？辜淄枋巧綎|省立醫(yī)院內分泌科趙家軍教授治療甲狀腺腫的驗方，已獲國家專利，具有益氣活血、軟堅散結之功效，臨床用以治療單純性甲狀腺腫、結節(jié)性甲狀腺腫和毒性甲狀腺腫多年，可使腫大的甲狀腺顯著縮小，未發(fā)現明顯毒副作用。然而其治療甲狀腺腫的具體機制仍有待深入探討。本研究擬從血管生成、細胞凋亡和細胞增殖的角度來探討抗甲丸治療甲狀

9、腺腫的機制。 研究目的： 1.應用雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型，觀察抗甲丸的抗血管生成效應。 2.應用組織學和蛋白印跡等方法，探討抗甲丸對實驗性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細胞凋亡的影響。 3.應用免疫組化和蛋白印跡等方法，探討抗甲丸對實驗性甲狀腺腫大鼠甲狀腺細胞增殖的影響。 研究方法： 1.雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型 種雞蛋37℃，60％濕度，孵化72小時。然后將雞蛋取出，小心將雞蛋殼打開，

10、將種蛋的內容物放入10×10cm Falcon細胞培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中，37℃，60％濕度，4％co2濃度培養(yǎng)2天。將直徑5mm的圓形Whatman定性濾紙，盡量選取血管分布相似的區(qū)域，放到雞胚絨毛尿囊膜上。將藥物加到濾紙上，每天加藥一次，5天后，將雞胚放于體視顯微鏡下進行觀察拍照并計數濾紙周邊10mm范圍內的血管分支點數目。 2.實驗性大鼠甲狀腺腫模型制備和實驗分組 雄性wistar大鼠編號后，隨機分為4組：正常

11、對照組，模型對照組，低劑量抗甲丸治療組和高劑量抗甲丸治療組。后三組在飲水中加入甲巰咪唑誘導甲狀腺腫大直至實驗結束。飲用甲巰咪唑一周后，后兩組開始灌服抗甲丸，劑量分別為250mg/kg、1000mg/kg，每天一次。同時模型對照組給予等量的水灌服。在服用抗甲丸4周、8周、12周時經頸靜脈竇采血測定甲狀腺功能和TSH。服用抗甲丸12周后，大鼠麻醉處死，完整切取甲狀腺組織。一部分放入4％多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片；一部分用3％戊二醛固定

12、，用于電鏡觀察；最后一部分放入液氮中保存，用于蛋白印跡分析。 3.組織學方法 包括HE染色、電鏡、TUNEL、免疫組織化學等。同時用Image-Pro Plus6.0軟件對微觀形態(tài)和免疫組化的結果進行定量分析。 4.蛋白印跡法 研究結果： 1.通過雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型的研究，與空白對照組相比，抗甲丸低、高兩個劑量組的血管形態(tài)和血管分支點無顯著性差異，未發(fā)現抗甲丸有抑制血管生成的作用。

13、 2.甲巰咪唑誘導形成實驗性大鼠甲狀腺腫，在此模型中，甲狀腺功能明顯改變，TT3、TT4顯著降低，而TSH顯著的升高。未發(fā)現抗甲丸對大鼠甲狀腺功能和TSH有顯著影響。 3.模型對照組與正常對照組相比，甲狀腺指數增長7倍。與模型對照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組的甲狀腺指數分別減小10％和21％。低高劑量抗甲丸治療組的差異不具有統(tǒng)計學意義。 4.HE染色表明模型對照組的甲狀腺細胞數目增多，細胞及細胞核肥大，90％以上的

14、的濾泡結構和膠質消失。經抗甲丸治療后，甲狀腺細胞數目減少，濾泡結構和膠質有所恢復。電鏡表明抗甲丸治療組細胞核破裂、染色質邊集和胞漿空泡化等凋亡現象明顯增加。 5.TUNEL的結果表明低、高劑量抗甲丸治療組的凋亡甲狀腺細胞數量顯著多于正常對照組和模型對照組。定量分析表明低、高劑量抗甲丸治療組TUNEL陽性細胞數較模型對照組比有顯著性差異，高劑量抗甲丸治療組的凋亡陽性細胞數是低劑量抗甲丸治療組的1倍多。 6.活性caspas

15、e-3免疫組織化學結果顯示，在正常對照組和模型對照組，甲狀腺組織中極少有活性caspase-3的表達。與模型對照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組活性caspase-3的表達明顯增強，同時高劑量抗甲丸治療組的表達顯著多于低劑量抗甲丸治療組。蛋白印跡的結果表明，另外3組較正常對照組，caspase-3的蛋白表達分別增加2.7、3.6和5.3倍，表明抗甲丸的治療可以顯著增加caspase-3的蛋白表達，呈劑量依賴性。 7.蛋白印跡分

16、析結果表明Fas在抗甲丸治療組的蛋白表達明顯增強，與模型對照組相比，低劑量抗甲丸治療組增加了45％，高劑量抗甲丸治療組則增加了103％。 8.PCNA的免疫組化染色結果顯示，與正常對照組相比，模型對照組PCNA的蛋白表達明顯增強。而與模型對照組相比，低劑量和高劑量抗甲丸治療組的表達顯著減弱，高劑量抗甲丸治療組的降低更為明顯。蛋白印跡的結果與免疫組化的結果一致，PCNA的蛋白表達在模型對照組較正常對照組明顯增強，而低劑量和高劑量抗

17、甲丸治療組的表達較模型對照組分別降低45％和58％。 9.cyclin D1的蛋白印跡結果表明，與正常對照組相比，模型對照組的cyclin D1的蛋白表達明顯增強。而與模型對照組比較，低劑量和高劑量抗甲丸治療組cyclin D1的蛋白表達分別減弱25％和39％，高劑量抗甲丸治療組的減弱更為顯著。 研究結論： 1.抗甲丸沒有抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成的效應。 2.在甲巰咪唑誘導的大鼠甲狀腺腫模型中，抗甲丸可