褐藻糖膠對小鼠乳腺癌的體內外抵制作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:褐藻糖膠(fucoidan)是從海帶中提取純化的一種多糖,其主要組成為褐藻糖、硫酸根,以及少量糖醛酸、半乳糖、木糖。褐藻糖膠具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、增強免疫力等生物學功能,使之成為天然海洋藥物研究的熱點。研究證實,褐藻糖膠對腸癌、乳腺癌、肝癌和白血病等均有明顯的抑制作用,并能誘導細胞凋亡,而對正常細胞無毒副作用,但對其具體的作用機制尚未闡明。本研究以小鼠乳腺癌細胞4T1為靶細胞,采用體外培養(yǎng)細胞(體外實驗

2、)及建立荷瘤小鼠模型(體內實驗)方法從分子水平、細胞水平及動物整體水平探討褐藻糖膠的抗腫瘤活性及其作用機制,為最終將該藥開發(fā)成為一種新型的天然抗癌藥物奠定基礎。
　　 方法:1.體外實驗:體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌細胞4T1,采用MTT比色法、熒光染色、流式細胞術(flowcytomary,FCM)、RT-PCR、Westernblotting等方法,觀察不同濃度褐藻糖膠對4T1細胞增殖和凋亡的影響,探討褐藻糖膠體外的抗腫瘤活性及其作用

3、機制。2.體內實驗:培養(yǎng)4T1細胞接種Balb/c小鼠建立荷瘤小鼠模型,觀察褐藻糖膠對荷瘤小鼠移植瘤生長的抑制情況,TUNEL染色檢測瘤組織凋亡細胞,Westernblot及免疫組化等方法檢測褐藻糖膠處理后瘤組織內Bcl-2/Bax、生存素(Survivin)、β連環(huán)蛋白(β-catinin)、細胞周期蛋白Cyclin-D1和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK4以及血管內皮生長因子(VEGF)等相關蛋白的表達,探討褐藻糖膠體內的抗腫瘤活性

4、及其作用機制。
　　 結果:1.體外實驗:褐藻糖膠(0、50、100、200μg/ml)作用4T1細胞48h后,在熒光顯微鏡下觀察到褐藻糖膠處理組細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變:細胞核固縮、有DNA碎片;RT-PCR及Westernblot結果顯示,隨褐藻糖膠濃度的增加,Bcl-2mRNA和蛋白表達均下降、BaxmRNA和蛋白表達升高,導致Bcl-2/Bax比值下降;凋亡抑制蛋白Survivin表達增加;線粒體膜電位下降,細胞色素

5、C由線粒體向細胞漿釋放增加,Caspase-3的活化率逐漸增加,明顯高于對照組(P＜0.05):MTT比色結果顯示褐藻糖膠能抑制4T1細胞增殖;細胞周期分析表明,經(jīng)50、100、200μg/ml褐藻糖膠處理48h后,G1期4T1細胞數(shù)明顯增加,呈明顯的G1期阻滯;Westernblot結果顯示隨褐藻糖膠濃度增加,β-catinin、CyclinD1和細胞周期依賴激酶CDK4表達逐漸減少(P＜0.05)。另外,褐藻糖膠處理后,VEGF表達

6、也出現(xiàn)減少(P＜0.05)。2.體內實驗:結果顯示褐藻糖膠能抑制荷瘤小鼠移植瘤的增長;TUNEL染色顯示褐藻糖膠明顯促進腫瘤組織內細胞凋亡;Westernblot結果顯示Bcl-2/Bax比值降低和Survivin的表達下降;免疫組化檢測到β-catinin、CyclinD1、CDK4和VEGF的表達減少,腫瘤組織微血管密度降低;癌灶在肺部的轉移率下降。
　　 結論:褐藻糖膠能明顯誘導4T1細胞凋亡和細胞周期G1期阻滯,抑制小鼠