豚鼠肝外膽道系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)制及其與膽結(jié)石的相關(guān)性研究.pdf

1、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitialcellsofCajal，ICCs)是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家SantiagoRamonyCajal在1893年應(yīng)用甲基藍(lán)和鍍銀染色，在豚鼠和家兔小腸描述的一種細(xì)胞。100多年來(lái)，學(xué)者們通過(guò)對(duì)胃腸壁內(nèi)ICCs的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、起源以及生理功能等一系列的研究，初步明確ICCs是一種特殊的間質(zhì)細(xì)胞，以細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形式分布于整個(gè)胃腸道。它能產(chǎn)生自發(fā)性電慢波、參與神經(jīng)信號(hào)的整合與傳遞，對(duì)胃腸平滑肌節(jié)律性運(yùn)動(dòng)具

2、有重要調(diào)控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，除胃腸道外，其它一些具有自主節(jié)律性的器官或組織，也存在類似ICCs的細(xì)胞，稱Cajal樣細(xì)胞，受到學(xué)者的關(guān)注，成為新的研究熱點(diǎn)。 與胃腸平滑肌相似，膽道平滑肌也存在自發(fā)節(jié)律性運(yùn)動(dòng)，但其調(diào)控機(jī)制并不清楚。新近研究表明，人的正常膽囊、膽囊癌組織和壺腹均存在Cajal樣細(xì)胞，可能與產(chǎn)生自發(fā)節(jié)律性電活動(dòng)有關(guān)，對(duì)膽道系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)功能、正常壓力的維持以及防止膽汁返流等具有重要調(diào)節(jié)作用，但目前對(duì)于Cajal樣細(xì)胞在

3、膽道系統(tǒng)的詳細(xì)分布、形態(tài)特征、功能以及調(diào)控因素研究尚不完全清楚。據(jù)報(bào)道一氧化氮(nitricoxide,NO)對(duì)胃腸平滑肌的抑制作用是通過(guò)調(diào)節(jié)ICCs細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)的，那么NO對(duì)Oddi括約肌運(yùn)動(dòng)的抑制作用是否通過(guò)Cajal樣細(xì)胞介導(dǎo)有必要進(jìn)一步研究。闡明這一問(wèn)題，對(duì)于深入理解膽道系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)功能調(diào)控機(jī)制及其與相關(guān)疾病的關(guān)系具有重要指導(dǎo)意義。膽結(jié)石是膽道系統(tǒng)臨床上常見(jiàn)的疾病之一，目前對(duì)于它的病因和發(fā)病機(jī)制并不清楚，但多數(shù)研究表明膽囊運(yùn)動(dòng)功能

4、減弱在膽石形成過(guò)程中起重要作用。鑒于Cajal樣細(xì)胞在膽道系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)調(diào)控中的重要性，那么在膽石形成過(guò)程中，Cajal樣細(xì)胞的分布、形態(tài)功能變化等將是一個(gè)非常有趣的問(wèn)題。 因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用KIT蛋白特異性抗體，進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色、NADPH-d組織化學(xué)方法和肌電活動(dòng)記錄等技術(shù)，結(jié)合分層鋪片和冰凍切片，對(duì)豚鼠肝外膽道系統(tǒng)包括膽囊、膽囊管、肝總管、膽總管、十二指腸壺腹、Oddi括約肌(sphincterofOddi)等部位Caj

5、al樣細(xì)胞的形態(tài)和分布、膽道系統(tǒng)NO神經(jīng)分布以及與膽結(jié)石形成的相關(guān)性等，進(jìn)行較詳細(xì)的研究，期望本研究能為深入理解膽道系統(tǒng)自主節(jié)律性運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)制以及與膽結(jié)石形成的相關(guān)性等提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要材料和方法： 1.應(yīng)用KIT蛋白特異性抗體(ACK2)對(duì)膽道各部位的全層鋪片或冰凍切片進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色，顯示Cajal樣細(xì)胞的形態(tài)、分布，并對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較。 2.采用針刺電極或粘膜接觸電極分別記

6、錄SO、膽總管和膽囊的肌電活動(dòng)，分別對(duì)其頻率和波幅進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 3.NADPH-d組織化學(xué)與c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)雙重染色顯示NO神經(jīng)與Cajal樣細(xì)胞的相關(guān)性。 4.通過(guò)喂養(yǎng)致膽石飼料建立豚鼠膽結(jié)石模型，比較分析膽道Cajal樣細(xì)胞及肌電活動(dòng)的變化與結(jié)石形成的相關(guān)性。 主要結(jié)果如下： 一、豚鼠肝外膽道系統(tǒng)Cajal樣細(xì)胞的形態(tài)和分布 1.全層鋪片和切片均可見(jiàn)Cajal樣細(xì)胞存在于整個(gè)肝外膽道。

7、在肝管、膽囊管和膽囊，Cajal樣細(xì)胞主要位于肌層，細(xì)胞呈梭形，有兩個(gè)較短突起，無(wú)分支。在膽總管的上段，Cajal樣細(xì)胞僅見(jiàn)環(huán)行排列，接近中段出現(xiàn)縱行平滑肌的同時(shí)，逐漸出現(xiàn)縱行的Cajal樣細(xì)胞，分布在環(huán)縱平滑肌之間和肌層內(nèi)。從膽總管上段至下段，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，突起逐漸伸長(zhǎng)。肌內(nèi)的Cajal樣細(xì)胞呈長(zhǎng)梭行，有兩個(gè)突起；而環(huán)縱肌層間的細(xì)胞常呈星型，接近壺腹附近的細(xì)胞突起相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀。上述結(jié)果表明豚鼠整個(gè)膽道系統(tǒng)均存在Cajal樣細(xì)胞

8、，為膽道系統(tǒng)自主節(jié)律運(yùn)動(dòng)的調(diào)控提供了新的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。 2.壺腹部位的膽總管分為外側(cè)壁和內(nèi)側(cè)壁，均可見(jiàn)Cajal樣細(xì)胞。外側(cè)壁的Cajal樣細(xì)胞體呈橢圓形或者三角形，突起常有1-3個(gè)分支或三個(gè)以上，相互連接形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，與十二指腸肌間神經(jīng)叢周圍ICC相似。在外側(cè)壁環(huán)肌的內(nèi)面Cajal樣細(xì)胞與十二指腸深肌叢附近的ICC相似。壺腹內(nèi)側(cè)壁肌層內(nèi)可見(jiàn)大量的Cajal樣細(xì)胞，與平滑肌細(xì)胞平行分布。於壺腹開(kāi)口處，Cajal樣細(xì)胞圍繞開(kāi)口形成一

9、個(gè)密集的細(xì)胞環(huán)，而緊鄰壺腹開(kāi)口部位，Cajal樣細(xì)胞排列成環(huán)行和縱行。Cajal樣細(xì)胞數(shù)量的逐漸增多和形態(tài)的多樣性，提示可能與該部位的復(fù)雜生理功能調(diào)控有關(guān)。 二、豚鼠膽囊、膽總管和Oddi括約肌的肌電活動(dòng) 1.在壺腹、膽總管和膽囊均可記錄到肌電活動(dòng)，表現(xiàn)為峰電位活動(dòng)波，波形有較好的一致性，多為雙向波，且三者峰電位的頻率相同，但波幅以壺腹最大，膽總管次之，膽囊最小。 2.在kreb-ringer液中加入藥物硝普鈉(

10、NO供體)，峰電位活動(dòng)頻率和波幅顯著降低并迅速消失，提示NO對(duì)Cajal樣細(xì)胞的活動(dòng)具有明顯的抑制作用。 三、豚鼠肝外膽道系統(tǒng)Cajal樣細(xì)胞與NOS神經(jīng)分布模式 1.NADPH-d組化染色可見(jiàn)NOS陽(yáng)性神經(jīng)分布于整個(gè)肝外膽道系統(tǒng)；在肝管、膽囊、膽囊管和膽總管上段，NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維較稀疏，散在分布，主要位于肌內(nèi)；而在膽總管下段和壺腹處，NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維較密集，廣泛分于肌間神經(jīng)叢和肌內(nèi)，以肌間神經(jīng)叢最豐富，構(gòu)成該神經(jīng)叢

11、的組成部分。 2.NADPH-d組織化學(xué)與c-kit免疫細(xì)胞化學(xué)雙重染色可見(jiàn)NOS神經(jīng)纖維和Cajal樣細(xì)胞在壺腹部位肌間神經(jīng)叢各自形成獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)，未見(jiàn)二者有共存現(xiàn)象，但二者間的距離較近，部分膨體樣終術(shù)分布在Cajal樣細(xì)胞的胞體和突起周圍，可能為NO調(diào)控Cajal樣細(xì)胞功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 四、膽結(jié)石模型豚鼠Cajal細(xì)胞形態(tài)及膽道肌電活動(dòng)的研究 在膽固醇結(jié)石的豚鼠膽囊和膽道系統(tǒng)未見(jiàn)Cajal樣細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量有明