脂質體介導抑制素基因轉染對牛卵泡細胞及胚胎發(fā)育的影響及機制研究.pdf

1、本研究應用細胞培養(yǎng)、質粒提取、脂質體轉染、RT-PCR(反轉錄PCR)、TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法)、RIA(放射免疫測定)和流式細胞分類等技術，利用本實驗室構建的卵泡抑制素α亞基片段基因重組質粒即pEGISI，轉染不同大小的牛卵泡顆粒細胞及卵母細胞，研究pEGISI在顆粒細胞、卵母細胞中的表達以及對顆粒細胞激素分泌、細胞增殖和細胞凋亡以及對卵母細胞成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的影響，以探討卵泡抑制素對卵泡發(fā)育

2、的局部調節(jié)作用及作用機制。主要內容如下： 1.pEGISI轉染對卵泡顆粒細胞增殖、凋亡、激素分泌及共培養(yǎng)的卵母細胞和胚胎發(fā)育的影響 為了了解抑制素基因轉染卵泡的顆粒細胞后基因表達對顆粒細胞增殖、凋亡和激素分泌，以及轉染的顆粒細胞同卵母細胞共培養(yǎng)對卵母細胞成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的影響。本試驗利用pEGISI質粒轉染來源于牛中腔(直徑，>4mm-8mm)、小腔(直徑，1mm-4mm)顆粒細胞，轉染后48h、96h分別檢測顆

3、粒細胞的增殖、凋亡及雌激素和孕酮的分泌量，并檢測共培養(yǎng)后的卵母細胞的發(fā)育情況。結果顯示，脂質體介導的pEGISI轉染顆粒細胞后，來自中腔卵泡的顆粒細胞增殖率(88.8±2.1％；平均值±標準差)顯著低于對照組(100％)和轉染pEGFP組(97.5±2.1％)，對小腔卵泡顆粒細胞的增殖在各組之間無顯著差異。pEGISI轉染顆粒細胞后顯著加劇了顆粒細胞的凋亡。轉染顆粒細胞48h后雌激素分泌量均增加，而孕酮分泌量下降。轉染后的中腔卵泡顆粒細

4、胞與卵母細胞共培養(yǎng)，降低了卵母細胞的成熟率(61.5±6.8％vs.71.2±5.7％，P<0.05)，但對體外受精和胚胎發(fā)育沒有影響。這些結果表明，pEGISI在顆粒細胞中的超表達對顆粒細胞的增殖、凋亡和卵母細胞成熟有著重要的調節(jié)作用，其作用因顆粒細胞發(fā)育時期不同而異。 2.pEGISI轉染卵母細胞對其成熟及胚胎發(fā)育的影響 為了了解抑制素基因對卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育的影響，本試驗利用pEGISI質粒直接轉染卵母細胞，然

5、后檢測抑制素基因在卵母細胞中的表達，以及轉染的卵母細胞成熟率和體外受精后胚胎發(fā)育情況，結果顯示： (1)脂質體介導的抑制素片段轉染能夠成功地通過透明帶進入卵母細胞，并且能夠高效表達。 (2)轉染本身對卵母細胞成熟及體外受精能力沒有傷害。 (3)高效表達的抑制素片段對卵母細胞的成熟，體外受精以及胚胎發(fā)育沒有影響。 3.pEGISI轉染卵母細胞復合體對其成熟及胚胎發(fā)育的影響 為了進一步了解抑制素基因對

6、卵母細胞復合體成熟及胚胎發(fā)育的影響。本試驗用pEGISI質粒轉染牛卵母細胞復合體，檢測pEGISI在卵母細胞復合體中的超表達、卵丘細胞擴散、凋亡和激素分泌、以及卵母細胞復合體成熟、體外受精和胚胎發(fā)育的情況。結果顯示：質粒pEGISI轉染牛卵丘卵母細胞復合體，對中、小卵泡的卵丘細胞擴散有抑制作用，對中腔卵泡卵丘細胞的抑制作用尤為顯著(69.8±2.7％，p<0.05)。質粒pEGISI轉染加劇了中、小卵泡卵丘細胞的凋亡，對中腔卵泡卵丘細胞