21-羥化酶缺陷癥基因診斷方法的建立及應用.pdf

1、目的：
　　通過熒光偏振檢測技術聯合直接測序法，建立一種針對21-羥化酶缺陷癥進行基因診斷的新方法，并用新建立的檢測體系對中國人群中21-羥化酶缺陷癥最常見的2種基因缺失和8種基因點突變進行檢測，驗證該體系的準確性及臨床可實施性，并對檢測到的基因突變進行分析，探討基因型與臨床表型之間的關系。
　　方法：
　　收集40例正常人及3例21-羥化酶缺陷癥患者外周血，提取基因組DNA。設計通用引物，同時擴增 CYP21A2和C

2、YP21A1P等位基因片段，然后用擴增產物與特異的 TAMRA熒光標記探針分別進行雜交，利用熒光偏振儀檢測雜交產物的熒光偏振值(FP)，從而確定是否存在該基因的缺失，同時用直接測序法驗證檢測結果；對Exon3 Del8bp(GAGACTAC)缺失進行檢測時，為確保引物特異性，將缺失的8個堿基設計在引物上，同時根據 CYP21A2基因與其假基因 CYP21A1P部分序列之間的差異，設計5對特異性引物用于擴增CYP21A2基因，PCR后直接

3、測序檢測中國人群中21-羥化酶缺陷癥最常見的8種基因點突變，即P30L、i2g、I172N、E6Cluster、V281L、920-921insT、Q218X、R356W突變。
　　結果：
　　熒光偏振法未檢測到CYP21A2基因大片段缺失，檢測結果與直接測序法一致率達100％。40例正常人均無點突變，21-羥化酶缺陷癥患者中1例檢測出 G56R、c.920-921InsT雜合突變，2例檢測出I172N、Q318X雜合突變。