腦血管痙攣中差異表達蛋白質(zhì)的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 腦血管痙攣(CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后常見而又嚴重的并發(fā)癥,其發(fā)生機制尚未完全明了,治療亦無特效方法,是神經(jīng)科學領域的世界性難題。本課題首次應用蛋白組學的研究方法如:雙向凝膠電泳(2-DE)、質(zhì)譜分析等,鑒定CVS中差異蛋白質(zhì)的表達,并應用Western blotting驗證差異表達蛋白質(zhì),為繼續(xù)探討腦血管痙攣的分子機理、尋找有臨床應用潛能的分子靶點奠定基礎。企盼通過實施本課題研究,為進一步明確腦血管痙攣

2、的機理及尋找有效治療方法提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、兔蛛網(wǎng)膜下腔二次出血模型的建立:新西蘭大白兔24只,隨機分成正常對照組(C)和CVS組(T),每組再分成三份分別為:C1、C2、C3和T1、T2、T3每份四只。采用兔二次蛛網(wǎng)膜下腔出血模型[1]。正常對照組同樣進行穿刺但不注血。
　　 2、DSA檢測腦血管痙攣以及形態(tài)學觀察:在建立模型前及建立模型后第3天分別行腦血管造影,比較基底動脈直徑的變化；二次

3、注血第3天造影后行胸廓切開術,甲醛灌注固定,取附有基底動脈的腦組織,切成4μm厚薄片行HE染色。光鏡下觀察形態(tài)學變化,包括血管壁厚度、內(nèi)彈力層皺褶及平滑肌細胞收縮等的變化。
　　 3、雙向電泳,銀染及質(zhì)譜鑒定:各組動物在行DSA造影后處死取腦,分離腦基底動脈,提取總蛋白,雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析技術檢測及鑒定腦血管痙攣時基底動脈蛋白質(zhì)表達的變化。
　　 4、Western blotting驗證差異蛋白:選取CVS中高表達蛋

4、白Arginase作為目標蛋白引用Arginase阻斷劑后,實驗分成正常對照組、SAH-3d組、Arginase+SAH-3d組,應用Western blotting檢測Cx43蛋白表達的變化。
　　 結果:
　　 1、成功建立兔二次SAH后CVS模型:二次蛛網(wǎng)膜下腔出血組后第3天與第0天相比顯示基底動脈顯著狹窄(64.2％±0.5％P<0.01)。正常對照組與第0天的直徑相比較無顯著差別(89.3％±8.1％)。光鏡下

5、顯示:正常組腦血管內(nèi)皮細胞分布均勻,核橢圓,淡染；其下內(nèi)彈力層平滑;平滑肌細胞均勻分布,較緊密；SAH組的血管內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)聚集;內(nèi)彈力膜顯著波紋狀;平滑肌細胞分布稀疏,周圍紅染組織明顯增多,核長梭形,內(nèi)彈力膜及平滑肌層間有水腫。
　　 2、雙向凝膠電泳圖譜及分析:通過imagemaster5.0軟件分析CVS和正常基底動脈組織雙向凝膠電泳圖譜,選取同組內(nèi)三張膠重復出現(xiàn)的斑點參與比較,以體積百分比作為比較值,選擇灰度體積(即表

6、達含量)比值在1.5倍以上的斑點作為差異斑點。得到差異表達蛋白質(zhì)點數(shù)共49個,其中14個點在CVS中為低表達,35個點在CVS中為高表達。
　　 3、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫查詢結果:用Mascot搜索SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫對總共49個差異蛋白點進行分析鑒定,共鑒定成功其中35個差異表達蛋白點:在CVS中高表達的有24個,其余11個在CVS中呈低表達。
　　 4、Arginase阻斷劑可顯著減弱CVS后引起的Cx43蛋白表達