中藥紅景天對高糖條件下大鼠心肌微血管內皮細胞及其生長因子作用的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　 1.采用消化法體外培養(yǎng)出純度較高的大鼠心肌微血管內皮細胞（MMVECs）備用。
　　 2.與培哚普利作對照，觀察紅景天含藥鼠血清對高糖條件下大鼠MMVECs的增殖活力、MMVECs上清液中血管內皮生長因子（VEGF）分泌量和MMVECs內VEGF基因表達水平的影響。
　　 [方法]
　　 新生5-7天Wistar大鼠，開胸心臟取材，用冷D-Hanks液反復沖洗3次，采用二次消化法（0.25

2、％胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化）分離、培養(yǎng)MMVECs，利用差速貼壁法和亞細胞克隆法純化MMVECs，用Ⅷ因子和CD31相關抗原進行鑒定。
　　 取培養(yǎng)至第3代的MMVECs，在培養(yǎng)基中加入50mmol/L Glu、含50mmol/LGlu的紅景天（NDK）高、中、低劑量含藥血清和培哚普利（PD）含藥血清進行培養(yǎng)，72h時行MTT比色實驗觀察MMVECs增殖活性的變化，透射電鏡下觀察MMVECs超微結構的變化，并檢測MMVECs上清

3、液中VEGF的分泌量及MMVECs內VEGF基因表達水平。
　　 [結果]
　　 1.成功培養(yǎng)出純度較高的MMVECs，可用于該項實驗研究。
　　 2.MTT比色實驗：各組隨培養(yǎng)時間的延長，OD值有所上升，72h時各糖濃度下的OD值比48h上升顯著，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。72h時，與正常對照組比較，各濃度組OD值都有所降低，以50mmol/L和75mmol/L時OD值的降低最為顯著（P<0.01）

4、。用50mmol/LGlu培養(yǎng)72h時，NKD低組和PD組的OD值較50mmol/LGlu組顯著升高（均P<0.01），但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 3.透射電鏡下觀察：高糖條件下MMVECs出現(xiàn)指狀突起，溶酶體增多，線粒體腫脹，粗面內質網(wǎng)擴張。NDK低組含藥血清作用后能改善這種損傷，其作用與PD組相似。
　　 4.ELISA法檢測：高糖組、NDK高、中、低組和PD組MMVECs上清液中VEGF分

5、泌量較正常對照組均顯著降低（均P<0.01）；與高糖組相比，NDK中、低組和PD組MMVECs上清液中VEGF分泌量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。NDK低組和PD組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 5.QT-PCR法檢測：高糖組、NDK高、中、低組及PD組MMVECs VEGF-mRNA表達水平較正常對照組顯著降低（P<0.01）。與高糖組相比，NDK低組MMVECsVEGF-mRNA表達增高，差異非常顯

6、著（P<0.01），PD組MMVECsVEGF-mRNA表達也增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。NDK低組與PD組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 [結論]
　　 1.采用二次消化法原代培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁法+亞細胞克隆法純化的新生Wistar大鼠MMVECs，經(jīng)Ⅷ因子和CD31相關抗原免疫熒光鑒定后，純度可達95％以上，可用于正式實驗。
　　 2.高糖對MMVECs的增殖有抑制作用。NDK低劑

7、量組能促進高糖條件下MMVECs的增殖，其作用與PD組相近似。
　　 3.透射電鏡下能觀察到高糖對MMVECs超微結構的損傷，NDK低劑量組能改善這種損傷，其作用與PD組相似。
　　 4.高糖條件下，MMVECs上清液中VEGF分泌量及MMVECs內VEGF基因表達水平顯著降低。NDK低劑量組可上調MMVECs上清液中VEGF的分泌量及MMVECs內VEGF的基因表達水平，其作用優(yōu)于PD組。
　　 [創(chuàng)新點]