中間錦雞兒miR2118的克隆與功能鑒定及CiDR1與CiDR2基因的表達(dá)研究.pdf

1、miRNA是一類在真核生物中發(fā)現(xiàn)的小型、非編碼RNA，長(zhǎng)度21-24nt，在進(jìn)化和功能上保守。miRNA能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，若配對(duì)完全則導(dǎo)致靶mRNA被切割，配對(duì)不完全則導(dǎo)致靶mRNA轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。大量的研究表明，miRNA在植物應(yīng)對(duì)多種環(huán)境脅迫如干旱、鹽堿和極端溫度等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。干旱是自然災(zāi)害中對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量影響最大的環(huán)境因素，在我國(guó)，每年因干旱造成的作物產(chǎn)量減少多達(dá)5000噸，因此，更加有效的抗旱育種

2、研究亟待開(kāi)展。中間錦雞兒（Caragana intermedia）系豆科、蝶形花亞科小型灌木，主要分布在我國(guó)山西、內(nèi)蒙等西北、華北的干旱草原及荒漠地區(qū)。中間錦雞兒是錦雞兒屬植物中分布最廣、實(shí)用性最強(qiáng)的一個(gè)種，具有廣泛的適應(yīng)性和抗逆性，因此是研究植物抗旱機(jī)制的理想樹(shù)種。
　　miR2118在植物中被篩選為抗旱相關(guān)基因，但其對(duì)抗旱的調(diào)節(jié)作用并未得到實(shí)驗(yàn)證明。我們以中間錦雞兒實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料，研究了干旱對(duì)miR2118及其目標(biāo)基因表達(dá)水

3、平的調(diào)控作用，并在煙草中過(guò)表達(dá)了miR2118前體，分析了ci-miR2118對(duì)煙草抗旱能力的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)在中間錦雞兒中預(yù)測(cè)并克隆了miR2118的2個(gè)目標(biāo)基因CiDR1、CiDR2全長(zhǎng)，并對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有TIR、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域，同屬于TIR型抗病基因。但因兩個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)所處位置不同進(jìn)而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在它們的編碼區(qū)內(nèi)都有miR2118的結(jié)合位點(diǎn)，表明它們可能會(huì)受到miR21

4、18的調(diào)控。
　　(2)qRT-PCR結(jié)果顯示，miR2118及其目標(biāo)基因在中間錦雞兒幼年期協(xié)同表達(dá)，在成年期miR2118與CiDR1表達(dá)模式相反，與CiDR2表達(dá)模式相近。miR2118與2個(gè)目標(biāo)基因CiDR1和CiDR2在中間錦雞兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中皆有表達(dá)，可能參與生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成途徑，且不同成員間在干旱脅迫條件下存在差異性表達(dá)。
　　(3)干旱脅迫下，CiDR1與CiDR2表達(dá)量被誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，表明CiDR基因?yàn)楦珊?/p>

5、相關(guān)基因。干旱脅迫下，miR2118對(duì)CiDR1為負(fù)調(diào)控，模式符合“此消彼長(zhǎng)”進(jìn)一步證實(shí)CiDR1為目標(biāo)基因;而對(duì)CiDR2全程正調(diào)控，我們推測(cè)CiDR2可能是miR2118的調(diào)整型目標(biāo)基因，其表達(dá)受miR2118調(diào)控使得CiDR2編碼的蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)水平能夠均勻。
　　(4)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR2118的煙草中ci-miR2118表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，煙草中ci-miR2118表達(dá)量有著極大的升高，其中莖中升高量最多，達(dá)野生型的150

6、倍。干旱處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草失水速度變慢、保水能力得到提升，而這種提升與miR2118的表達(dá)量呈正相關(guān)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR2118能夠增強(qiáng)植物保水能力。
　　(5)過(guò)表達(dá)miR2118的煙草表型有很大的改變，表現(xiàn)在:莖木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)增加、細(xì)胞致密、直徑增大、根數(shù)增多、根長(zhǎng)縮短、根直徑增粗。該結(jié)果說(shuō)明ci-miR2118能夠影響植物正常形態(tài)建成，可能是生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，為深入研究該基因功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　綜上所示，mi