Osteopontin在TGF-β1介導的肝纖維化中的作用和機制研究.pdf

1、肝纖維化是細胞外基質產生與降解失衡導致的細胞外基質堆積，各種慢性肝損傷因素均可導致肝纖維化。嚴重的肝纖維化臨床診斷為肝硬化，如果缺乏有效的干預措施，可向肝臟衰竭，甚至肝癌進展。
　　在肝纖維化過程中，肝星狀細胞的作用越來越受到研究者的重視，它是目前公認的細胞外基質的主要來源。正常情況下，肝星狀細胞存在于竇周間隙，主要發(fā)揮儲藏維生素A的功能。在損傷信號的刺激下，靜止的肝星狀細胞會轉分化為活化的肌成纖維樣細胞，表現(xiàn)出增殖能力增強，凋亡

2、率降低，生成細胞外基質能力增強等特性。肝星狀細胞的活化需要各種細胞因子如PDGF、TGF-β1、leptin和VEGF等通過自分泌或旁分泌作用維持。其中TGF-β1被公認為肝星狀細胞活化的最強刺激因子。
　　本研究的興趣分子骨橋蛋白（Osteopontin，OPN)）是一種分泌性的磷酸化糖蛋白，在體內廣泛表達，參與多種生理病理過程。主要通過與細胞膜表面的整合素受體和CD44結合發(fā)揮作用。越來越多的證據表明OPN參與了機體的纖維化過

3、程。我們的前期研究在HBV引起的肝纖維化患者的血漿中發(fā)現(xiàn)，OPN與肝纖維化程度密切相關。同時，有研究報道OPN在不同情況下都可以受到TGF-β1的誘導參與TGF-β1下游的生理病理過程。這些結果都提示OPN在纖維化過程中的作用與TGF-β1信號通路有關。
　　本研究的目的為研究OPN在肝硬化患者組織和血漿中的表達；探討其促人肝星狀細胞活化機制。
　　首先，我們通過免疫組化染色觀察61例肝硬化患者和23例正常對照肝組織中OPN

4、表達，分析其與Child-Pugh分級、MELD評分和并發(fā)癥發(fā)生的相關性；ELISA檢測31例肝硬化患者血漿中OPN和TGF-β1的表達并分析二者相關性。免疫組化結果顯示，肝硬化組織中OPN表達陽性率（46/61）顯著高于正常對照(9/23，P=0.000)。同時OPN表達強度與Child-Pugh分級、MELD評分和并發(fā)癥發(fā)生具有相關性(P=0.000，P=0.000，P=0.005)。肝硬化患者血漿中，OPN與TGF-β1的表達量呈

5、正相關（PearsonCorrelation:0.621，P=0.000）。
　　接下來，我們利用慢病毒過表達/干涉人肝星狀細胞系LX-2中OPN的表達。我們構建了基于FUW和pLKO.1的慢病毒過表達/干涉載體，與包裝質粒共轉染293T細胞包裝慢病毒顆粒。經慢病毒介導，過表達/干涉人肝星狀細胞系LX-2中OPN的表達。通過qPCR、westernblot檢測細胞中OPN表達情況，結果證實慢病毒過表達/干涉有效。
　　為探討

6、OPN過表達/干涉對人肝星狀細胞系LX-2活化表型的影響，我們通過CCK8檢測、qPCR技術在人肝星狀細胞系LX-2中，觀察LX-2增殖及活化標志物的變化。結果顯示，OPN上調可促進LX-2增殖，促進肝星狀細胞活化標志物（α-SMA,CollagenI,TIMP1）的表達，OPN下調則導致相反結果。
　　為進一步明確OPN在肝纖維化情況下上調的機制，我們著重研究TGF-β1在人肝星狀細胞系LX-2中對OPN的轉錄調控。我們構建了O

7、PN啟動子載體，結合生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因實驗研究OPN上游轉錄調控機制。結果顯示，OPN可受到TGF-β1的正性轉錄調控。結合生物信息學分析和以往發(fā)表文獻，鎖定轉錄因子RUNX2作為研究對象。結果顯示，TGF-β1可上調轉錄因子RUNX2表達，而RUNX2可增強OPN啟動子活性，且結合生物信息學分析和啟動子截短分析，初步確定RUNX2作用位點位于啟動子序列的-78～-73的ACCACA。
　　綜上所述，我們得到以下結