幼兔病毒性出血癥免疫失敗原因及防制措施的研究.pdf

1、兔出血癥是家兔的一種烈性傳染病，以發(fā)病急、傳播速度快、死亡率高為特點(diǎn)，并主要感染3月齡以上成年兔，曾給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。幾年以前，通過(guò)疫苗注射可較好地控制本病。但是近年來(lái)，3月齡以下、甚至2月齡以下幼兔時(shí)有發(fā)病，給該病的防控提出了新問(wèn)題。究竟是抗原變異的原因還是免疫程序的問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。本研究首先對(duì)華東三省RHD的病原進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)三個(gè)分離毒株的基因序列、致病性和免疫原性進(jìn)行了比較，研究了幼兔出血癥的免疫程序，并

2、探討了中藥佐劑對(duì)疫苗的免疫增強(qiáng)作用和作用機(jī)理。本研究的目的，旨在尋找理想的免疫程序和疫苗佐劑，為幼兔出血癥的防控提供理論依據(jù)。具體內(nèi)容為以下六個(gè)部分： 試驗(yàn)I、華東三省RHDV的分子流行病學(xué)調(diào)查 為了弄清兔出血癥病毒的流行規(guī)律，從2005年到2007年對(duì)山東、江蘇、安徽三個(gè)養(yǎng)兔大省的家兔的帶毒情況進(jìn)行了調(diào)查。首先建立了RHDV RT-PCR檢測(cè)方法，按照GenBank上公布的RHDV基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以RHDV發(fā)病兔

3、的新鮮兔肝為材料，提取總RNA，進(jìn)行cDNA的合成和PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，擴(kuò)增出與預(yù)期的269bp大小一致的片段，該產(chǎn)物序列與公布的RHDV基因序列有95.8％～98.5％的同源性。然后對(duì)RT-PCR方法的敏感性、特異性和RHDV的臟器分布進(jìn)行試驗(yàn)．結(jié)果表明，RT-PCR方法的敏感性是HA的1×104倍，對(duì)RHD發(fā)病死亡兔，能從除糞便以外的各種臟器中檢測(cè)到病毒。運(yùn)用建立的RT-PCR方法對(duì)采集的不同日齡段的兔鼻拭樣品和出入

4、境兔肉產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)選擇數(shù)個(gè)分離毒株進(jìn)行測(cè)序和序列比較。結(jié)果，400份出入境兔肉產(chǎn)品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，512份鼻拭子中有48份陽(yáng)性樣品，表明兔出血癥病毒在華東三省廣泛存在，不同日齡段兔之間的帶毒率存在顯著性差異；而不同年份、不同省份兔之間帶毒率差異不顯著；序列比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株不同序列，其與Genbank上已公布序列的同源性為93.7％～99.6％。 試驗(yàn)II、幼兔RHDV三個(gè)分離株的基因序列、致病性和免疫原性比較

5、為了研究幼兔RHDV與疫苗株RHDV的區(qū)別，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)幼兔RHDV的3個(gè)分離株(HN、SH、DY株)和疫苗對(duì)照FY株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行VP60序列測(cè)定、序列比對(duì)和蛋白質(zhì)同源性分析；用4個(gè)毒株對(duì)兔只進(jìn)行攻毒，記錄死亡時(shí)間和死亡率，比較致病性差異；用4個(gè)毒株制成疫苗，免疫家兔，比較其免疫原性。結(jié)果，3個(gè)分離株的基因序列同源性為95.2％～97.4％，氨基酸同源性為95.8％～99.3％；4個(gè)毒株的致死率、致病病程和病

6、毒血凝性沒(méi)有顯著性差異；4個(gè)疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體為同一血清型，各個(gè)疫苗均可以抵抗其它毒株的攻擊，表明幼兔RHDV的3個(gè)分離株與疫苗株之間的免疫原性無(wú)顯著差異。 試驗(yàn)III、免疫日齡對(duì)兔病毒性出血癥抗體水平產(chǎn)生的影響 試驗(yàn)1通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)比較了新西蘭家兔0、1、2、3和4log2 5種抗體水平對(duì)的病毒性出血癥(RHD)的保護(hù)效果，結(jié)果表明，抗體效價(jià)高于3 log2時(shí)可產(chǎn)生100％的保護(hù)，2 log2的保護(hù)率僅為50％。

7、 試驗(yàn)2測(cè)定了30、35、40、45、50、55和60日齡非免疫兔的母源抗體效價(jià)和用RHD組織滅活苗免疫后8周內(nèi)血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母源抗體與日齡呈負(fù)相關(guān)，在30日齡時(shí)最高，可以產(chǎn)生有效的保護(hù)，在40日齡后已無(wú)保護(hù)作用；免疫日齡與抗體峰值和有效保護(hù)時(shí)間呈正相關(guān)，30日齡免疫，抗體效價(jià)不但不升、反而顯著下降，無(wú)保護(hù)作用；35日齡免疫，抗體峰值較低，有效保護(hù)時(shí)間僅為2周；大于40日齡免疫，抗體峰值較高，有效保護(hù)時(shí)間延長(zhǎng)。

8、 試驗(yàn)IV、幼兔出血癥免疫程序的研究 試驗(yàn)1選擇35、40、45三種日齡新西蘭家兔各30只，每個(gè)日齡兔隨機(jī)均分為5組，對(duì)照組注射生理鹽水，4個(gè)試驗(yàn)組分別注射4種劑量(1mL、2mL、3mL、4mL)的兔病毒性出血癥疫苗，對(duì)照組注射生理鹽水，分別于免疫前及免疫后1～7周內(nèi)采血測(cè)定血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，各日齡兔的2mL、3 mL、4 mL劑量組的抗體上升速度和有效抗體維持時(shí)間均顯著大于同日齡的1 mL劑量組；35日齡

9、兔的2 mL、3 mL、4 mL劑量組的抗體峰值顯著高于1 mL劑量組。35日齡一次性注射疫苗2mL，其抗體效價(jià)在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)顯著高于二次注射1mL疫苗的抗體效價(jià)。 試驗(yàn)2比較兩種免疫程序的免疫效果，結(jié)果表明，1次性免疫2mL組的抗體水平在大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)顯著高于兩次免疫1mL組。以上結(jié)果提示35日齡免疫、注射劑量2 mL為最佳免疫程序。 試驗(yàn)V、中藥佐劑對(duì)RHD疫苗的免疫增強(qiáng)作用 為了增強(qiáng)兔出血癥疫苗的免疫效果，選擇

10、4中藥成分(黃芪多糖，淫羊藿多糖，蜂膠黃酮，人參皂甙)組成2個(gè)復(fù)方，分別與兔出血癥疫苗混合后免疫幼兔，以鋁膠苗和無(wú)佐劑苗為對(duì)照，分別于免疫后7、14、21、28、35、49天采血，用微量血凝法測(cè)定血清抗體的動(dòng)態(tài)變化，用MTT法測(cè)定外周血T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)變化；于免疫后63天測(cè)定免疫器官指數(shù)并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明，復(fù)方1在部分時(shí)間點(diǎn)能顯著提高血清抗體效價(jià)，復(fù)方2在多數(shù)時(shí)間點(diǎn)能顯著提高血清抗體效價(jià)；兩個(gè)復(fù)方在第7天顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞

11、轉(zhuǎn)化，在第7～21天顯著促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；兩個(gè)復(fù)方顯著增大圓小囊、腸淋巴結(jié)器官指數(shù)，提高保護(hù)率。 試驗(yàn)VI、中藥佐劑對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步證實(shí)兩個(gè)中藥成分復(fù)方佐劑的免疫增強(qiáng)作用，并探討其作用機(jī)理，比較了兩個(gè)復(fù)方對(duì)培養(yǎng)的兔外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用，運(yùn)用熒光定量RT-PCR方法比較了兩個(gè)復(fù)方對(duì)兔外周血淋巴細(xì)胞IFN-γ、IL-10 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，兩個(gè)中藥成