雞腸炎沙門氏菌SM6△cpxR-lon-hilA和SM6△cpxR-lon-hilA-cpdB基因缺失株的構建及其保護效力評價.pdf

1、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica，SE）是一種兼性細胞內病原菌，能夠引起多種動物發(fā)病。疫苗免疫是阻止SE進入食物鏈的一種有效方式，相對于滅活疫苗而言，弱毒疫苗對預防SE的腸道定植和全身性感染具有更好的效果。因此，研究一種安全、有效的疫苗是控制SE傳播的首要任務。
　　SE存在許多毒力相關基因，這些毒力相關基因的連鎖作用，能夠保證SE在營養(yǎng)缺乏的特殊宿主環(huán)境中生存并避免被宿主免疫系統(tǒng)清除。SE入侵宿主細胞是沙門氏

2、菌感染的一個重要階段，其入侵宿主細胞的過程需要侵襲基因的表達，hilA基因是對侵襲基因表達控制的一個主導者。環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶（cpdB）基因可以水解細胞內第二信使（cAMP，環(huán)磷酸腺苷或cGMP，環(huán)磷酸鳥苷），從而終結這些第二信使所傳導的對細胞活動有重要調節(jié)功能的生化作用。為了進一步致弱SE的毒力，本研究通過Red重組的方法，在本實驗室已構建雙基因缺失菌株SM6△cpxR/lon基礎上，通過缺失hilA基因和cpdB基因構建了無抗性標

3、記的三基因缺菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB，對基因缺失菌株的生物學特性進行了初步研究，并開展了缺失株的致病性試驗、免疫條件優(yōu)化和免疫攻菌試驗，為研究開發(fā)SE基因工程弱毒疫苗奠定了基礎。本研究主要內容包括:
　　(1)三基因缺失菌株和四基因缺失菌株的構建
　　利用PCR技術擴增出兩端與雞腸炎沙門氏菌6(SM6) hilA基因上、下游同源臂且中間為氯霉素抗性基因

4、的DNA片段，電擊轉化含有質粒pKD46的SM6△cpxR/lon中，獲得替換hilA基因的陽性轉化子（SM6△cpxR/lon△:hilA∷Cat），再導入溫度敏感質粒pCP20去除氯霉素抗性基因，通過PCR與序列測定鑒定，成功構建了hilA基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA，并以此為基礎進一步缺失了cpdB基因，從而構建了四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB。
　　(2)基因缺失菌株的生物學特性

5、研究
　　將獲得的三基因缺失菌株和四基因缺失菌株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過PCR鑒定，表明三基因缺失菌株和四基因缺失菌株均能夠穩(wěn)定遺傳。將野生株SM6、三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB于LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，繪制其生長曲線。結果表明，三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA與親本株SM6在體外增殖能力沒有明顯差異，而四基因缺失株SM6△cpxR/lon

6、/hilA/cpdB的生長能力明顯弱于三基因缺失株和親本株，說明hilA基因的缺失沒有影響細菌的生長速度與能力，而cpdB基因的缺失會對細菌的生長速度產(chǎn)生一定的影響。利用微生物鑒定系統(tǒng)，測定SM6、三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB對95種碳源的利用能力。結果表明，在碳源利用能力上，從四基因缺失菌株到三基因缺失菌株再到SM6親本株依次減弱。
　　(3)基因缺

7、失株對雛雞的致病性試驗
　　LD50試驗結果表明，三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB LD50是SM6 LD50的215倍，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB LD50是SM6 LD50的1931倍，三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA和四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB的毒力均有所下降，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB的

8、毒力下降了將近2000倍，對雛雞的致病性明顯低于SM6。
　　三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA、四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB和SM6分別腹腔注射7日齡的SPF雞，分別于注射后的第2天、第4天、一直到第12天無菌采取雞的肝臟、脾臟和小腸，比較三個菌株在雞體不同組織的定植情況。結果發(fā)現(xiàn)基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在注射后的第10

9、天在雞的肝臟、脾臟和小腸只能分離到比較少的沙門氏菌，均顯著低于(p＜0.05) SM6在肝臟、脾臟和小腸的分離情況。基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA和SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在雞體內的定植情況均明顯低于野生株SM6。
　　(4)基因缺失株株對雛雞的免疫保護試驗
　　通過對免疫途徑和免疫劑量的摸索，制定了最佳的免疫程序。將64只7日齡SPF雞共隨機分為4組，即試驗Ⅰ組（SM6△cpxR/lon/

10、HilA組，免疫劑量為1×108 CFU/mL）、試驗Ⅱ組（SM6△cpxR/lon/HilA/cpdB組，免疫劑量為1×109 CFU/mL）、試驗Ⅲ組（滅活苗組）和對照組(PBS)，每組16只。肌肉注射，共免疫3次，每次免疫間隔兩周，一免后每周翅靜脈采血，分離血清，間接ELISA方法檢測血清IgG。每次免疫后2周用ELISA方法檢測血清中IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌情況，流式細胞儀檢測CD4+及CD8+T細胞亞群動態(tài)變化，于

11、第3次免疫后7天，以野生株SM6進行攻菌。攻菌1周后，剖殺未死亡雞只，結合雞的存活率和內臟病理變化，綜合評價基因缺失株的免疫保護效果。
　　試驗結果表明，四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB組和滅活苗組雞的血清抗體水平明顯高于三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA組，且各試驗組抗體水平均高于對照組，四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB組和滅活苗組均能產(chǎn)生良好的體液免疫，且兩組差異不明

12、顯。各個免疫組外周血IL-2、IL-6、IFN-γ均呈上升趨勢，結合CD4+、CD8+T細胞亞群的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)四基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB疫苗和三基因缺失株SM6△cpxR/lon/hilA疫苗均可以誘發(fā)良好的細胞免疫。攻菌后第7天，四基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA/cpdB在盲腸、肝臟和脾臟的荷菌數(shù)均低于三基因缺失菌株SM6△cpxR/lon/hilA組和滅活苗組;從攻菌保護效果看，四基因