DAXX亞細胞定位對ox-LDL誘導巨噬細胞凋亡的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:觀察DAXX的亞細胞定位對ox-LDL誘導RAW264.7巨噬細胞凋亡的影響,為開辟以DAXX的亞細胞定位為手段,穩(wěn)定斑塊、防治急性冠脈綜合征的新途徑提供理論依據(jù)。
  方法:構建人源性DAXX胞核定位突變質粒DAXX(S667A)、胞漿定位突變質粒DAXX(W621A);瞬時轉染RAW264.7巨噬細胞,應用RT-PCR和Western Blot技術檢測轉染后細胞內(nèi)DAXX的表達情況和轉染效率;同時,應用免疫熒光法觀察DA

2、XX在細胞中的定位情況;轉染24h后用100μg/mL ox-LDL孵育48h,誘導細胞凋亡,MTT法檢測細胞活性,流式細胞術觀察細胞凋亡情況。應用 RT-PCR和Western Blot分別檢測ASKI和JNK的mRNA和蛋白的表達情況。
  結果:DAXX的兩個突變重組質粒DAXX(S667A)和DAXX(W621A)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序分析,證實突變正確,無其它突變和讀碼框移位。RT-PCR和Western Blot

3、法檢測轉染后細胞內(nèi)DAXX表達的升高有顯著性差異,表明轉染效率達到實驗要求。免疫熒光法觀察到DAXX(WT)在胞核胞漿均有表達,且主要定位于胞核;質粒DAXX(S667A)定位胞核;質粒DAXX(W621A)定位胞漿。瞬時轉染24h后細胞經(jīng)100μg/ml ox-LDL孵育48h,與正常對照組比較,MTT法和流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn):轉 DAXX(W621A)組細胞活性顯著下調(diào),凋亡率明顯上升(p<0.05);轉DAXX(S667A)組細胞活

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