人源抗TNF-α駱駝化抗體的制備研究.pdf

1、目的：
　　 抗體由于具有高特異性和高親和力的特性，使其在科學(xué)研究、疾病診斷和治療中顯示出無(wú)可比擬的優(yōu)越性。隨著市場(chǎng)對(duì)抗體藥物的重視和需求，也對(duì)抗體的穩(wěn)定性提出更高的要求。本研究為探索抗體的穩(wěn)定性改構(gòu)策略，以抗TNF-α抗體為研究對(duì)象，在VH/K基因的基礎(chǔ)上利用定點(diǎn)突變方法和噬菌體抗體展示技術(shù)，構(gòu)建噬菌體展示人源駱駝化單域抗體(sdAbs)基因庫(kù)，篩選制備人源抗TNF-α的穩(wěn)定、高親和力的單域抗體。同時(shí)，構(gòu)建膜穩(wěn)定型TNF-α真

2、核表達(dá)細(xì)胞株，制備抗體評(píng)價(jià)模型，以期進(jìn)一步篩選出同時(shí)針對(duì)可溶型TNF-α(S-TNF)和膜穩(wěn)定型TNF-α(M-TNFm)的抗體。
　　 方法：
　　 1.人源TNF-α重組蛋白的制備:采集健康人血液從中分離出淋巴細(xì)胞，經(jīng)脂多糖刺激后提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將TNF-α基因克隆入原核表達(dá)載體pET28b(+)中，并轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，制備并純化人源可溶型TNF-α重組蛋白。
　　

3、 2.抗人TNF-αsdAbs基因庫(kù)的構(gòu)建:對(duì)人源抗體基因VH進(jìn)行駱駝重鏈抗體(HcAb)的特征性改造，即利用定點(diǎn)突變技術(shù)將人普通抗體框架區(qū)FR2中，V37、G44、L45和W47這4個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基突變?yōu)镠cAb中相對(duì)應(yīng)的親水性氨基酸殘基F37、E44、R45和G47，并將突變成功的VH基因克隆入pCANTAB-5E載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化入Ecoli.TG1感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建抗人TNF-αsdAbs基因庫(kù)。
　　 3.抗人TNF-αs

4、dAbs的特異性篩選及鑒定:以制備的人源TNF-α重組蛋白做為篩選抗原，對(duì)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”特異抗體的親和篩選，并對(duì)經(jīng)篩選得到的單克隆進(jìn)行ELISA特異性鑒定。
　　 4.M-TNFm重組蛋白的克隆表達(dá):為使人TNF-α以一種不會(huì)被酶解的膜穩(wěn)定型表達(dá)于細(xì)胞膜表面，應(yīng)用PCR方法去除TNF-α轉(zhuǎn)換酶的酶解部位編碼序列(Val1-Pro12)成功構(gòu)建TNF-α膜穩(wěn)定型蛋白(M-TNFm)的突變體基因(mT

5、NFm)。將其克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建pCDNA3.1(+)-mTNFm-EGFP重組質(zhì)粒，并經(jīng)Lipofectamine2000脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，瞬時(shí)表達(dá)M-TNFm蛋白。
　　 5.抗體評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建:以小鼠成纖維細(xì)胞(L929)為靶細(xì)胞，觀察S-TNF和M-TNFm對(duì)其細(xì)胞毒性作用;加入抗TNF-α抗體后，觀察抗體對(duì)L929細(xì)胞的保護(hù)作用;以此確定制備的S-TNF和M-TNFm是否可用于抗體的活性評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果

6、：
　　 1.制備了人S-TNF重組蛋白:構(gòu)建pET28b(+)-TNF-α重組質(zhì)粒并在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了人TNF-α的可溶性表達(dá)。經(jīng)鎳柱及AKATA系統(tǒng)純化得到純度較高的S-TNF重組蛋白。
　　 2.成功構(gòu)建了抗人TNF-αsdAbs基因庫(kù):通過(guò)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)成功將人源抗體VH基因FR2區(qū)4個(gè)疏水性氨基酸殘基突變?yōu)橛H水性氨基酸殘基。將突變成功的VH基因克隆入pCANTAB-5E載體，轉(zhuǎn)化入Ec

7、oli.TG1構(gòu)建抗人TNF-αsdAbs基因庫(kù)，庫(kù)容量為3×107。
　　 3.抗人TNF-αsdAbs的特異性篩選:使用噬菌體抗體展示技術(shù)篩選出2株ELISA值較高的特異性抗人TNF-αsdAbs。
　　 4.人M-TNFm的克隆表達(dá):成功制備了mTNFm突變體基因，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-mTNFm-EGFP。采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體法將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)293FT細(xì)胞，熒光顯微鏡

8、下觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為38％。
　　 5.抗體評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建:以L929細(xì)胞為靶細(xì)胞，制備的S-TNF和經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)M-TNFm的293FT細(xì)胞對(duì)其都有細(xì)胞毒性作用;經(jīng)抗TNF-α抗體中和后，對(duì)L929細(xì)胞殺傷作用減小;抗體評(píng)價(jià)模型基本構(gòu)建成功，制備的S-TNF和M-TNFm可以用于制備抗體的活性評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)論：
　　 1.基于定點(diǎn)突變技術(shù)和噬菌體抗體展示技術(shù)，成功篩選制備了人源抗TNF-α特異、穩(wěn)定的駱