甘藍型油菜BnF3’H基因的反義轉化.pdf

1、甘藍型油菜(Brassica napus L.)是世界四大油料作物之一。甘藍型黃籽油菜與黑籽油菜相比較，具有種皮色素少、種皮薄、纖維素含量低以及蛋白質和含油量高的優(yōu)點，因而培育遺傳穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的甘藍型黃籽油菜已成為油菜育種的一個重要目標之一。 研究表明，植物種皮色素的主要成分是原花青素(proanthocyanidins，PAs)的聚合物，它是由苯丙烷-類黃酮-花青素-原花青素復合途徑而合成的。類黃酮3’-羥化酶(flav

2、onoid3'-hydroxylase，F(xiàn)3'H)是類黃酮途徑中的關鍵酶之一，對于花青素和原花青素的生物合成起重要作用。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中F3'H基因的功能失活性突變均導致種皮顏色由野生型的深褐色變成黃色或灰褐色，即透明種皮(TRANSPARENT TESTA，TT)，突變體命名為tt7。 本課題組從前的研究已經(jīng)克隆了甘藍型油菜的F3'H(BnF3'H)基因的全長序列，完成了原核表達、RT-PC

3、R等功能鑒定，并構建了反義植物表達載體，但尚未完成轉化油菜本身的功能鑒定和轉基因分子育種研究。為此，本研究將該反義植物表達載體轉化了甘藍型油菜黑籽優(yōu)良新品種中雙10號，并取得了以下結果： 1.以中雙10號下胚軸為受體，獲得了優(yōu)化的遺傳轉化技術體系。本研究在參考油菜轉化的國際先進技術的基礎上，結合本研究的實際情況，對影響油菜轉化的一些重要技術因素進行了單因素尋優(yōu)研究，綜合各試驗結果后得到了一套優(yōu)化的中雙10號轉化技術體系。取8d齡

4、幼苗的中雙10號無菌苗下胚軸段，接入MSp培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3d，然后在OD600=0.2的農(nóng)桿菌工程菌株菌液菌液中浸染5 min，轉入MSc固體培養(yǎng)基上中，于暗處、25℃共培養(yǎng)36h。殺菌后，外植體接種于MSi培養(yǎng)基14d以上，至誘導長出肉眼可見的抗性愈傷?？剐杂鷤D接于MSd培養(yǎng)基上約2～4周，誘導愈傷分化。分化后的外植體轉接于MSs培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)約2～4周，至長出小莖。分化出小莖外植體轉接于MSe培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)至莖伸長至約3～

5、4cm，并有數(shù)片真葉。長好莖及葉片的小苗轉接于MSr培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)約4～8周，至長出比較發(fā)達根系為止。馴化、寄栽和移栽后，進行相應分子檢測和性狀調查。 2.反義BnF3'H基因轉化中雙10號獲得一批轉基因陽性植株用根癌農(nóng)桿菌法，以下胚軸為外植體，采用前面所述的優(yōu)化方法，成功地將含有BnF3'H基因反義片段的T-DNA區(qū)段轉入了高產(chǎn)優(yōu)質的油菜新品種中雙10號，獲得了16株抗卡那霉素的再生植株，通過PCR檢測和GUS染色，證明有

6、7株轉基因陽性植株，陽性率為43.75％。證明外源T-DNA區(qū)段己經(jīng)整合入中雙10號轉基因植株的基因組中并具有表達活性。 3.反義抑制BnF3'H基因的表達后，油菜植株的花青素苷積累受到抑制對轉化反義BnF3'H基因的中雙10號的植株觀察發(fā)現(xiàn)，反義抑制BnF3'H基因對中雙10號植株外在性狀總體上沒有明顯影響，在沒有高溫和水份脅迫時轉基因和非轉基因植株的表面均沒有明顯的紫紅色花青素苷積累。但是，在自然氣候條件下并受到高溫干旱脅迫

7、時，非轉基因的陰性對照植株在較老的葉片上誘導產(chǎn)生了紅紫色的花青素苷，而轉基因植株則不明顯。初步說明，采用CaMV 35S啟動子組成性反義抑制BnF3'H基因的表達后，轉基因油菜的花青素苷積累能力受到明顯的抑制。該結果一方面從油菜本身的轉基因角度，證明了本課題組所克隆的BnF3'H基因的確是參與花青素合成的類黃酮途徑的關鍵酶基因，也表明對該基因的操作可以修飾油菜諸如花青素苷在內(nèi)的類黃酮成份和植株性狀。這些轉基因植株中花色和種皮色素性狀是否