線粒體功能障礙在慢性腎功能衰竭腎小管間質纖維化中的作用及干預研究.pdf

1、線粒體是真核細胞中含有核外遺傳物質的一類細胞器，主要調節(jié)細胞的能量代謝，是真核細胞賴以生存的基礎。線粒體主要功能有：合成機體所需的大部分三磷酸腺苷；氧化并清除細胞內過多的脂肪酸，同時阻斷非酯化脂肪酸進入循環(huán)血液；鈣穩(wěn)態(tài)的維持，同時調節(jié)細胞凋亡與死亡途徑。線粒體進行生命活動過程中能夠生成活性氧(ROS)，生理條件下，ROS很快被體內的抗氧化酶所清除，從而能夠維持ROS生成與被清除的平衡，當線粒體ROS產生異常增多或抗氧化能力下降，氧化應激

2、就會產生。線粒體源性的氧化應激亦可以引起內皮細胞線粒體滲透性轉變孔道的開放介導釋放炎癥因子，炎性反應的發(fā)生亦會破壞機體的穩(wěn)態(tài)。線粒體功能障礙導致的ATP合成減少、氧化應激以及炎癥反應等因素相互協(xié)同，影響，作用于多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前，業(yè)已證實線粒體功能障礙與神經退行性變，糖尿病，衰老等密切相關。慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是各類腎臟疾病終末期的共同表現，是以腎單位進行性損壞造成腎臟的排泄系統(tǒng)、

3、代謝內分泌功能紊亂的一組臨床癥候群，預后欠佳[12]。目前，CRF的治療主要為保護殘余腎單位，因此，尋找有效可靠的治療新靶點進行綜合治療有利于CRF的防控。線粒體發(fā)生功能障礙時ATP的合成量減少，氧自由基大量生成，炎癥因子釋放增多，這些因素大部分均伴隨于CRF的發(fā)生、發(fā)展，并最終促使CRF向ESRD轉化[13]。此外，腎小管間質纖維化是CRF發(fā)生、發(fā)展至ESRD期的共同通路，腎小管間質纖維化與CRF嚴重程度密切相關。因此，我們設想線粒體

4、功能障礙參與了CRF的腎小管間質纖維化，阻斷線粒體功能障礙能夠減輕CRF腎小管間質纖維化及癥狀，并延緩CRF進展。線粒體功能障礙一般都伴隨有炎癥反應的增加[21]，而炎癥反應在初始階段通常被認為是機體的適應性反應，持續(xù)性炎癥反應易造成機體的損傷。相對于特異性免疫反應（T、B細胞），天然免疫是機體抵抗病原微生物侵襲的第一道防線，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。天然免疫可以通過胞膜和胞漿的模式識別受體(PRR)識別各種感染性及非感染性的刺激。核

5、苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族(NOD)樣受體家族包含pyrin結構域蛋白3(NLRP3)是PRR大家族中NOD成員之一，在活化后可以招募凋亡相關斑點樣蛋白(CARD，ASC)及半胱天冬酶-1前體形成一個大分子蛋白復合物“NLRP3炎癥小體”，其使半胱天冬酶-1(caspase-1)活化，進而裂解IL-1β前體和IL-18前體，最終導致IL-1β和IL-18等促炎因子的產生與分泌，參與機體的炎癥反應。線粒體功能障礙與CRF通常都伴隨有持

6、續(xù)加重的炎癥反應，NLRP3炎癥小體的活化導致的IL-1β和IL-18的大量釋放已經被證實與腎臟疾病相關，本課題組前期實驗結果亦提示NLRP3炎癥小體基因敲除能夠抑制線粒體功能障礙并緩解白蛋白所誘導的腎小管上皮細胞(PTC)損傷。NLRP3炎癥小體亦參與了UUO模型的發(fā)病、發(fā)展，而UUO模型典型的腎臟病理改變即是腎小管間質纖維化，腎纖維化幾乎伴隨著CRF的整個發(fā)展階段。因此，我們設想下調NLRP3炎癥小體能夠通過阻斷線粒體功能障礙從而減

7、輕CRF腎小管間質纖維化及癥狀。本研究分為三個部分：
　　第一部分：線粒體功能障礙在慢性腎功能衰竭腎小管間質纖維化中的作用。
　　目的：探討線粒體功能障礙在CRF腎小管間質纖維化中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，應用轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激，抗氧化劑錳苯甲酸卟啉(Manganese(Ⅲ)5，10，15，20-tetrakis(4-benzo

8、ic acid) porphyrin，MnTBAP）預處理小鼠PTC，分為正常組、TGF-β1組、MnTBAP+ TGF-β1組。體內通過5/6腎切除術構建小鼠CRF模型，此外，應用MnTBAP腹腔注射小鼠，隨機分為4組:正常組、5/6腎切組、MnTBAP組、MnTBAP+5/6腎切組。應用real-time聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和western blot法檢測E-cadherin、V

9、imentin、α-平滑肌激動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、NLRP3、PPARγ的表達;應用電鏡檢測小鼠PTC內線粒體超微結構的變化;熒光探針DCHFDA染料結合流式細胞儀測定細胞內ROS水平; JC-1染色激光共聚焦并結合流式細胞術測定PTC線粒體膜電位;應用real-time PCR測定mtDNA的拷貝數;酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELIS

10、A)法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、血紅蛋白(hemoglobin，Hb); BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達;
　　結果：⑴TGF-β1呈時間依賴性抑制小鼠PTC E-cadherin的表達，促進Vimentin、α-SMA的表達。⑵TGF-β1呈濃度

11、依賴性的促進小鼠PTC ROS產生，以時間依賴性的降低線粒體膜電位、mtDNA拷貝數。電鏡觀察正常組小鼠PTC線粒體形態(tài)規(guī)則飽滿，線粒體嵴排列整齊清晰。TGF-β1呈時間依賴性誘導小鼠PTC線粒體形態(tài)腫脹加大，嵴模糊不清甚至消失。⑶5/6腎臟切除小鼠2周尿蛋白/肌酐比值開始顯著增高，8周尾動脈血壓明顯增高，12周脾臟重量明顯增加，Hb顯著下降，血清尿素氮，肌酐顯著增高，Masson染色提示小管間質纖維化明顯，腎組織PTC線粒體形態(tài)腫脹，

12、嵴模糊不清甚至消失。腎皮質mtDNA拷貝數顯著下降，腎皮質NLRP3 mRNA顯著增高，PPARγmRNA顯著下降。⑷MnTBAP抑制TGF-β1誘導的小鼠PTC ROS生成，逆轉線粒體膜電位和mtDNA拷貝數下降，上調E-cadherin表達，抑制Vimentin、α-SMA表達。⑸MnTBAP+5/6腎切組與5/6腎切組相比，腎小管間質纖維化顯著好轉，腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ蛋白表達和

13、mRNA相對量明顯減少，血清肌酐、尿素氮、脾臟重量、血壓下降、尿蛋白/肌酐比值下降，Hb上升。此外，MnTBAP+5/6腎切組較5/6腎切組，腎組織PTC線粒體超微結構改善;mtDNA拷貝數明顯增多。
　　結論：線粒體功能障礙參與了CRF腎小管間質纖維化及癥狀，阻斷線粒體功能障礙能夠減輕CRF腎小管間質纖維化及癥狀。
　　第二部分：PPARγ可減輕慢性腎功能衰竭線粒體功能障礙和腎小管間質纖維化。
　　目的：觀察PPAR

14、γ對CRF線粒體功能障礙和腎小管間質纖維化的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，瞬時轉染pcDNA3-h PPARγ質粒，分為四組:正常組、空載(Vehicle，Vehi)組、TGF-β1刺激組、PPARγ過表達+TGF-β1刺激組。體內實驗通過5/6腎切除構建CRF小鼠模型，隨機分為四組:正常組、5/6腎切除組、羅格列酮灌胃組、5/6腎切除+羅格列酮灌胃組。采用real-time PCR以及western blot方法檢測E-

15、cadherin、α-SMA、Vimentin的表達;電鏡檢測腎組織內PTC線粒體超微結構的變化;熒光探針DCHFDA染料法測定細胞內ROS水平;JC-1染色激光共聚焦并結合流式細胞術測定線粒體膜電位;應用real-time PCR法測定mtDNA的拷貝數;ELISA法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb;BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測

16、腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達。
　　結果：⑴PPARγ阻斷TGF-β1誘導的小鼠PTC ROS生成，逆轉線粒體膜電位和mtDNA拷貝數下降，改善線粒體超微結構、上調E-cadherin表達，抑制Vimentin、α-SMA表達。⑵5/6腎切+羅格列酮灌胃組與5/6腎切組相比，腎小管間質纖維化組顯著好轉，腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ蛋白表達

17、和mRNA相對量明顯減少，血清肌酐、尿素氮、脾臟重量、血壓下降、尿蛋白/肌酐比值下降，Hb上升。此外，5/6腎切+羅格列酮灌胃組較5/6腎切組，腎組織PTC線粒體超微結構改善;mtDNA拷貝數明顯增多。
　　結論：PPARγ可以減輕CRF腎小管間質纖維化及癥狀，這可能與抑制線粒體功能障礙有關。
　　第三部分：下調NLRP3可減輕慢性腎功能衰竭線粒體功能障礙和腎小管間質纖維化。
　　目的：觀察下調NLRP3對CRF線粒體

18、功能障礙和腎小管間質纖維化的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，瞬時轉染NLRP3小干擾RNA(small interferingRNA,SiRNA)，分為四組:正常組、Vehi組、TGF-β1刺激組、NLRP3-/-+TGF-β1刺激組。體內實驗通過5/6腎切除構建CRF小鼠模型，隨機分為四組:正常組、5/6腎切除組、NLRP3-/-組、5/6腎切除+NLRP3-/-組。應用real-time PCR和westernblot法

19、檢測E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表達;電鏡檢測小鼠PTC內線粒體形態(tài)的改變;采用熒光探針DCHFDA染料檢測細胞內ROS生成情況;JC-1染色激光共聚焦結合流式細胞術檢測線粒體膜電位;real-time PCR檢測mtDNA拷貝數。ELISA法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb; BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測

20、腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達。
　　結果：⑴下調NLRP3能阻斷TGF-β1誘導的小鼠PTC ROS生成，逆轉線粒體膜電位和mtDNA拷貝數下降，改善線粒體超微結構、上調E-cadherin表達，抑制Vimentin、α-SMA表達。⑵5/6腎切+NLRP3-/-組與5/6腎切組相比，腎小管間質纖維化組顯著好轉，腎皮質Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-