Mas基因沉默對血管緊張素-(1-7)拮抗血管緊張素Ⅱ誘導的腎間質成纖維細胞活化的影響.pdf

1、 目的：探討Mas基因沉默后對血管緊張素-(1-7) [angiotensin-(1–7),Ang-(1-7)]拮抗血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導的大鼠腎間質成纖維細胞(NRK-49F)活化的影響。方法：在體外傳代培養(yǎng)NRK-49F,當培養(yǎng)瓶中細胞生長至 70-80%融合后,用細胞培養(yǎng)基稀釋成密度為1×105/ml的細胞懸液并接種于六孔板中用于實驗。在我們的前期實驗中根據(jù) Mas 基因序列設計合成 3 對不同位

2、點的小分子干擾 RNA(small interfering RNA , SiRNA)并采用 HiPerFect Transfection Reagent 瞬時轉染 NRK-49F , 48h 后通過用半定量PCR(semi-quantitative PCR,RT-PCR)法檢測Mas mRNA的表達和用蛋白免疫印記法(Western blot)檢測 Mas 蛋白的表達,已證實 Mas SiRNA能有效的沉默Mas基因的表達并篩選出了對M

3、as基因沉默效果最佳的一對Mas SiRNA序列。為進一步研究有效Mas SiRNA沉默Mas基因后對Ang-(1-7)拮抗AngⅡ誘導的NRK-49F活化的影響,我們將已篩選出的有效序列Mas SiRNA瞬時轉染NRK-49F,根據(jù)不同的干預因素實驗分為6組：①正常對照組(NG)：細胞中僅加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基,即正常培養(yǎng)基,②AngⅡ組：細胞中加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ的正常培養(yǎng)基,③A

4、ng-(1-7)組：細胞中加入含終濃度為 10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基,④AngⅡ+ Ang-(1-7)組：細胞中同時加入含終濃度為10-6mol/LAngⅡ和終濃度為 10-5mol/LAng-(1-7) 的正常培養(yǎng)基,⑤陰性 SiRNA 對照組：細胞在陰性序列 siRNA 轉染 48h 后加入含 10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基,⑥Mas SiRNA轉染組：細胞在

5、有效 Mas siRNA 轉染 48h 后加入含 10-6mol/L AngⅡ和 10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培養(yǎng)基。將上述各組細胞分別培養(yǎng)72h后,采用細胞免疫化學法檢測 NRK-49F 活化標志物 α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測上清液中細胞外基質成分Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)的含量。結果：細胞免疫化學法檢測結果表明有

6、效 Mas SiRNA 轉染組在加 AngⅡ+Ang-(1-7)干預72h后,顯微鏡下可見細胞肥大,細胞胞漿所占體積比例增多,在胞漿內能觀察到棕黃色顆粒,界限清楚,與AngⅡ組的細胞形態(tài)相似,經(jīng)半定量分析數(shù)據(jù)結果顯示較非轉染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性 SiRNA 轉染組 α-SMA 表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而AngⅡ+ Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉染組α-SMA的表達無明顯差異(P>0.05),正

7、常對照組與 Ang-(1-7)組幾無 α-SMA的陽性表達。ELISA檢測結果表明細胞加AngⅡ+Ang-(1-7)干預72h后,有效Mas SiRNA轉染組較非轉染AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉染組細胞上清液中 ColⅠ的含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)組和陰性SiRNA轉染組上清液中ColⅠ的含量無明顯差異(P>0.05),正常對照組與Ang-(1-7)組細胞上清液中僅