TPX2在食管鱗癌組織中的表達及其與浸潤轉移關系的研究.pdf

1、食管癌(esophageal careinoma,EC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一,具有高侵襲性和高轉移傾向等生物學行為特點,其浸潤、轉移是導致患者死亡的主要原因。食管癌分布具有鮮明的地理區(qū)域特點,中國是食管癌的高發(fā)區(qū),而河南省是中國的高發(fā)省份。近年來,由于手術技術的改進、術前新輔助治療的開展、同步放化療的應用以及循證醫(yī)學研究方法的推廣,使得食管癌患者的生存期雖然明顯延長,生活質量也有一定的改善,但目前食管癌術后五年生存率僅為20-3

2、5％,其療效尚不令人滿意。因此,深入探討食管癌的浸潤轉移機制,進而提高食管癌的診療水平,已成為腫瘤學研究的熱點之一。
　　 TPX2(targeting protein for Xk1p2靶蛋白),又稱repp86(restricted expressedproliferation-associated protein86),是一種受細胞周期嚴格調控的核增殖相關蛋白,參與細胞有絲分裂的紡錘體微管功能。體內(nèi)、外實驗均表明TPX2過

3、表達導致細胞中心體擴增,出現(xiàn)DNA異倍體及多倍體,而腫瘤的發(fā)生與細胞增殖失控以及細胞凋亡調節(jié)紊亂密切相關,推測TPX2可能在食管癌的發(fā)生及進展中發(fā)揮作用,有關TPX2在食管癌中的表達及其與食管鱗癌浸潤轉移關系的研究,國內(nèi)外尚未見文獻報道。
　　 為了解TPX2基因與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移的關系,尋找早期檢測食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉移的指標及抑制食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉移的有效方法,本文采用免疫組化SP法和RT-PCR等分子生物學技

4、術,對食管鱗癌、不典型增生及正常食管黏膜組織等新鮮手術切除標本中的TPX2 mRHA和蛋白表達水平進行檢測,探討與食管癌疾病進展的關系。應用RNA干擾技術,利用化學合成的針對TPX2的siRNA并用脂質體將其轉染入EC9706細胞,采用免疫組化SP法、western blot、RT-PRC、細胞增殖抑制實驗MTT法、TUNEL技術和流式細胞技術,觀察轉染后EC9706細胞TPX2基因表達與腫瘤生長、細胞增殖,細胞凋亡和細胞周期變化,運用

5、Boyden chamber侵襲實驗觀察轉染前后細胞體外侵襲力的改變。最后又在建立裸鼠移植瘤模型的基礎上,采用RT-PCR、免疫組織化學等技術檢測了TPX2在裸鼠移植瘤中的表達,對比觀察了RNA干擾對裸鼠移植瘤生長的影響。系統(tǒng)地從體內(nèi)、外兩個方面探討了TPX2在食管鱗癌組織中的表達及其對浸潤轉移的影響,為食管癌的靶向基因治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 1.食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中TPX2的表達
　　

6、 采用免疫組織化學以及RT-PCR檢測62例食管鱗癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織中TPX2蛋白及mRNA的表達并進行形態(tài)學觀察。結果發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白陽性表達主要定位于癌細胞的胞核內(nèi),在正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中的表達水平依次逐漸升高,陽性率分別為4.8％、51.6％、85.5％,三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),并且TPX2蛋白的表達與淋巴結轉移和浸潤深度有關(P<0.05

7、),而與食管癌的組織學分級無關(P>0.05)。RT-PCR結果顯示正常食管上皮中TPX2 mRNA不表達或者弱表達,在食管癌組織中陽性表達率為65％,不典型增生癌旁組織中陽性表達率為35.5％。食管癌組織中TPX2的表達顯著高于不典型增生組織及正常上皮組織(x2=20.037,P<0.001)。TPX2在癌旁不典型增生組織及癌組織中mRNA的含量分別為0.627±0.084、0.879±0.046,組間比較有明顯差異(F=13.999

8、,P<0.05),而且表達水平與食管癌的浸潤和轉移相關(P<0.05)。但是TPX2蛋白或mRAN表達均與食管癌患者的性別、年齡、大體類型及腫瘤發(fā)生部位無關(P>0.05).
　　 2.RNA干擾對食管癌EC9706細胞株TPX2基因表達沉默的效果
　　 利用化學合成的siRNA轉染食管癌EC9706細胞,用脂質Lipofectamine2000作為siTPX2的轉染介質,將EC9706細胞株分為空白對照組、陰性對照組和

9、siRNA干擾組。空白對照組不予任何處理,陰性對照組加入包含非特異核昔酸序列的質粒,干擾組加入實驗篩選出的最有效干擾siRNA進行轉染。轉染后24h、48h、72h、96h應用RT-PCR和Western Blot方法檢測各組TPX2 mRNA及蛋白的表達。采用四甲基偶氮哇鹽光吸收法(MTT法)檢測EC9706細胞活力,熒光顯微鏡進行細胞凋亡的形態(tài)學檢測,繪制各組細胞的生長曲線以觀察siTPX2基因對細胞增殖能力的影響,采用TUNEL標

10、記技術觀察轉染前后細胞凋亡的數(shù)量變化,用流式細胞技術觀察細胞轉染后細胞周期的變化,并采用Boyden chamber實驗計算各組穿膜的細胞數(shù)以比較轉染siTPX2基因對細胞侵襲能力變化的影響。結果顯示,轉染siTPX2后24h、48h、72h、96h,EC9706細胞TPX2 mRNA以及蛋白的表達量與空白對照組和陰性對照組比較均顯著降低,且在72h最明顯。EC9706細胞的生長曲線在轉染siRNA后48h其增殖特性開始受到抑制,72h

11、抑制作用最為明顯,而陰性對照組和空白對照組的細胞生長曲線較為接近未受明顯影響。TUNEL技術檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)轉染siRNA后細胞凋亡數(shù)明顯增多,與空白對照細胞組和陰性對照細胞組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),流式細胞儀檢測轉染后細胞周期的變化,發(fā)現(xiàn)在轉染后72h細胞分裂受到抑制,G1期細胞減少而S期細胞增多,細胞周期阻滯在S期。Boyden chamber體外侵襲實驗結果顯示,siRNA細胞組穿越Matrigel的細胞數(shù)顯著減少(P<

12、0.05),而陰性對照組及空白對照組之間則無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.TPX2 siRNA對裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響
　　 分別將EC9706細胞組、陰性對照組(無關siRNA細胞組)和siRNA干擾組的食管癌細胞株EC9706注入裸鼠皮下,觀察裸鼠移植瘤的成瘤時間及成瘤率,比較各組裸鼠成瘤大小并應用RT-PCR和免疫組織化學方法檢測各組裸鼠腫瘤組織中TPX2的mRNA和蛋白表達。結果發(fā)現(xiàn)EC9706細胞組、

13、陰性對照組裸鼠移植瘤體積顯著大于siRNA干擾細胞組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而且TPX2蛋白及mRNA表達顯著高于siRNA干擾組的表達,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.人TPX2基因的分子克隆及真核表達載體的構建
　　 用pQE-70-TPX2原核表達載體為基礎,經(jīng)逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出人TPX2基因；限制性內(nèi)切酶SphI和BamHI雙酶

14、切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質粒,然后用T4 DNA Ligase連接,轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,PCR驗證轉化子,挑取陽性克隆擴大培養(yǎng),提取其質粒,進行SphI和BamHI雙酶切驗證,并經(jīng)酶切鑒定,DNA序列證實獲得的TPX2基因測序及BLAST分析證明克隆的人TPX2基因序列正確,成功構建了TPX2基因的真核表達載體pcDNA3.1-TPX2,為進一步的研究TPX2的生理功能和與其相關基因的關系奠定了基礎。
　　

15、結論
　　 1.首次發(fā)現(xiàn),TPX2蛋白及mRNA在食管不典型增生組織及食管鱗癌組織中呈高表達,且與食管癌的浸潤程度和淋巴結轉移有關,TPX2可能為腫瘤發(fā)生與轉移的早期指標。
　　 2.體外實驗表明,siRNA轉染細胞組可抑制EC9706細胞TPX2蛋白及mRNA的表達,抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力,將腫瘤細胞阻滯在S期并誘導腫瘤細胞凋亡。
　　 3.體內(nèi)實驗顯示。siRNA干擾明顯降低裸鼠移植瘤TPX2基因表達量