Foxp3通過下調(diào)CD44表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來以來，乳腺癌的發(fā)病率一直呈上升趨勢，全球每年約有100萬婦女被診斷為乳腺癌，近年以來，我國乳腺癌的發(fā)病率快速上升，已經(jīng)成為我國女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因之一，在臨床診斷時，約有10％的患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率僅為20%。因此，深入研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，明確通路中的受體和效應(yīng)分子之間的調(diào)控方式和特點，對于闡明

2、乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制意義重大。
　　叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3作為乳腺癌的抑制基因，近年來受到越來越多的關(guān)注。研究表明，在正常乳腺上皮細(xì)胞中存在Foxp3的表達(dá)，而在乳腺癌組織中，F(xiàn)oxp3低表達(dá)甚至缺失；Foxp3在乳腺癌中表達(dá)水平的下降導(dǎo)致了多種乳腺癌相關(guān)癌基因的表達(dá)調(diào)控異常，進(jìn)而促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；Foxp3基因突變的小鼠患乳腺腫瘤的幾率明顯增高，且對致癌物質(zhì)的敏感性增加；進(jìn)一步的實驗證明，F(xiàn)oxp3可以通過抑制癌基因HER-

3、2/ErbB2，SKP2的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。因此，F(xiàn)oxp3是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要的抑制基因，其功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明將為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展提供重要的線索，為乳腺癌的治療提供新的方法。
　　盡管大量的研究表明Foxp3能夠抑制乳腺癌的增殖，然而對于Foxp3在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的功能卻鮮有報道。Overbeck-Zu等研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中Foxp3的低表達(dá)會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨化因子驅(qū)動的轉(zhuǎn)移，提示 Foxp3可能會抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，

4、但機(jī)制尚不清楚，仍有很多問題有待深入探討：1、在乳腺癌臨床標(biāo)本中，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平的變化與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有無相關(guān)性？2、作為轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3在乳腺癌細(xì)胞中可以調(diào)控那些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)？3、Foxp3調(diào)控這些分子表達(dá)的機(jī)制是怎樣的呢？4、上調(diào)Foxp3表達(dá)后，能否抑制乳腺癌動物模型中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移？
　　上述問題的回答有助于闡明Foxp3抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，將豐富Foxp3作為乳腺癌抑制基因的功能。為此，我們進(jìn)行了下列研究工

5、作：①首先利用組織芯片技術(shù)，分析221例乳腺癌臨床標(biāo)本中Foxp3的表達(dá)水平，統(tǒng)計了其在正常乳腺組織及不同臨床分期的乳腺癌中的表達(dá)水平的差異，從而鑒定 Foxp3的表達(dá)水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。②其次，為了確認(rèn) Foxp3通過對哪些分子表達(dá)的調(diào)控從而參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移，我們還通過免疫組織化學(xué)、實時定量PCR、Western Blot分析了乳腺癌臨床標(biāo)本及乳腺癌細(xì)胞株中 Foxp3與細(xì)胞黏附分子 CD44表達(dá)水平之間的關(guān)系。③繼而，為了驗證

6、 Foxp3能否抑制乳腺癌中 CD44的表達(dá)，我們選用兩株低表達(dá) Foxp3的細(xì)胞系SKBr-3、MDA-MB-231，瞬時轉(zhuǎn)染Foxp3；選用兩株高表達(dá)Foxp3的細(xì)胞系MCF-7、T47D，采用siRNA技術(shù)干涉掉內(nèi)源的Foxp3，利用Western Blot，實時定量PCR觀察CD44表達(dá)水平的改變。④為了觀察Foxp3和CD44在細(xì)胞水平表達(dá)的相關(guān)性，采用流式分析技術(shù)，分別收集高表達(dá)/低表達(dá)CD44的MDA-MB-231細(xì)胞亞群

7、，運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析兩個不同細(xì)胞亞群中 Foxp3的表達(dá)水平。⑤運(yùn)用了雙熒光素酶報告基因、染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）和電泳遷移率實驗（EMSA）來闡明Foxp3調(diào)控CD44表達(dá)的機(jī)制。⑥利用Transwell和細(xì)胞黏附實驗明確Foxp3能否通過調(diào)控 CD44的表達(dá)來影響乳腺癌細(xì)胞的黏附和侵襲能力。⑦最后，利用動物活體成像技術(shù)證實在體內(nèi)環(huán)境中Foxp3能否抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。
　　通過以上實驗得到了下列結(jié)果：①通過組織芯片

8、技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，F(xiàn)oxp3在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著下降，這說明Foxp3與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。Foxp3在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平的降低或者缺失可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。②應(yīng)用SPSS13.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，CD44和Foxp3的表達(dá)水平在乳腺癌組織中呈負(fù)相關(guān)，提示兩者之間的關(guān)系密切，F(xiàn)oxp3可能是CD44表達(dá)的抑制基因。③通過上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中 Foxp3的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn) CD44的表達(dá)水平隨之降低

9、；而當(dāng)干涉掉 Foxp3后，則能促進(jìn) CD44的表達(dá)。從而明確了在乳腺癌細(xì)胞中 Foxp3能夠調(diào)控 CD44的表達(dá)。④細(xì)胞免疫熒光實驗明確了Foxp3和CD44蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布與定位，并進(jìn)一步證實了CD44的表達(dá)受到了Foxp3的調(diào)控。⑤運(yùn)用流式細(xì)胞分選技術(shù)證實在MDA-MB-231細(xì)胞中，高表達(dá) CD44細(xì)胞亞群的Foxp3表達(dá)水平低于低表達(dá)CD44的細(xì)胞亞群。⑥通過雙熒光素酶報告基因技術(shù)證實了Foxp3能夠影響 CD44啟動子的活

10、性；并通過構(gòu)建啟動子截短體的方法明確了Foxp3在CD44啟動子上的核心調(diào)控區(qū)。⑦CHIP實驗證實在細(xì)胞內(nèi) Foxp3能夠同CD44的啟動子結(jié)合。⑧EMSA實驗進(jìn)一步明確了Foxp3與CD44啟動子的結(jié)合作用。⑨通過尾靜脈注射方法建立裸鼠的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，運(yùn)用動物活體成像技術(shù)證實過表達(dá)Foxp3能夠抑制乳腺癌在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。
　　在本研究中，首次證實了Foxp3能夠通過調(diào)控 CD44啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制 CD44在乳腺癌中