靶向抑制延髓下行易化作用在大鼠骨癌痛中的鎮(zhèn)痛效應及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究擬通過探討從 RVM區(qū)投射到脊髓的5-HT能下行通路以及RVM區(qū)膠質細胞在骨癌痛大鼠疼痛機制中的作用,以期尋找癌痛治療的新靶點和新的治療策略。
　　研究方法與結果：
　　1.骨癌痛大鼠脊髓背角5-羥色胺含量的變化及意義
　　方法:實驗一(骨癌痛大鼠脊髓背角5-HT含量與其痛閾的相關性分析):雌性SD大鼠57只,隨機分為3組,每組19只。1)正常對照組(Na?ve):不作任何處理;2)假手術組

2、(Sham):于右側脛骨上段骨髓腔注射 D-hank’s液10μl;3)骨癌痛組(CIBP):于右側脛骨上段骨髓腔接種10μl(約3×104)Walker256大鼠乳腺癌細胞懸液制備脛骨癌痛模型。實驗二(鞘內注射5-羥色胺能選擇性神經毒素5,7-DHT對骨癌痛大鼠痛閾的影響):雌性 SD大鼠56只,隨機分為4組,每組14只。1) Sham-Saline組:假手術后第10天鞘內置管,第14天鞘內給生理鹽水(20μl);2) Sham-5,

3、7-DHT組:假手術后第10天鞘內置管,第14天鞘內給5,7-DHT(60μg);3) CIBP-Saline組:造模后第10天鞘內置管,第14天鞘內給生理鹽水(20μl);4) CIBP-5,7-DHT組:造模后第10天鞘內置管,第14天鞘內給5,7-DHT(60μg)。采用痛覺行為學和組織病理學方法鑒定模型構建成功。分別于術后第7、14和21天取各組大鼠脊髓背角組織,采用高效液相色譜法檢測脊髓背角組織中5-HT含量,并與相應時點的機

4、械縮爪閾值和縮爪持續(xù)時間做雙變量相關分析。檢測鞘內給予5,7-DHT對大鼠痛覺行為學的影響。采用高效液相色譜分析和免疫熒光染色檢測5,7-DHT對脊髓背角5-羥色胺能神經的毀損效應。
　　結果:腫瘤細胞接種后7～21 d大鼠機械縮爪閾值明顯降低,縮爪持續(xù)時間延長,移動誘發(fā)痛評分進行性升高(P<0.05)。光鏡下腫瘤注射部位可見大量腫瘤細胞浸潤,骨組織結構嚴重破壞,表明模型制備成功。與對照組相比,骨癌痛組大鼠接種后7～21 d時機械

5、痛閾降低,接種后7、14和21 d時脊髓背角5-HT含量升高,且5-HT含量與機械痛閾呈顯著相關(P<0.05)。鞘內注射5,7-DHT后可顯著降低脊髓背角中5-HT含量,并能顯著緩解骨癌痛大鼠的疼痛行為。
　　2.靶向抑制RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用在骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應評價
　　方法:雌性 SD大鼠108只,隨機分為4組,每組27只。1)Sham-Saline組:假手術后第14天 RVM區(qū)給生理鹽水(0.5μl);2

6、)Sham-PCPA組:假手術后第14天RVM區(qū)給 PCPA(50μg);3)CIBP-Saline組:造模后第14天 RVM區(qū)給生理鹽水(0.5μl);4)CIBP-PCPA組:造模后第14天 RVM區(qū)給 PCPA(50μg)。檢測各組大鼠不同時點的機械縮爪閾值、縮爪持續(xù)時間和移動誘發(fā)痛評分。免疫印跡法檢測 RVM區(qū) TPH的表達。高效液相色譜法檢測 RVM給藥后不同時點脊髓背角5-HT含量。應用免疫熒光染色法檢測 RVM區(qū)和脊髓背角

7、5-HT的表達。
　　結果:色氨酸羥化酶選擇性抑制劑 PCPA可下調 RVM區(qū)5-HT的表達,并可降低大鼠脊髓背角的5-HT含量(P<0.05)。行為學檢測發(fā)現,RVM區(qū)注射 PCPA后大鼠觸誘發(fā)痛閾值升高,縮爪持續(xù)時間縮短且移動誘發(fā)痛評分減低(P<0.05)。免疫熒光染色結果顯示 RVM區(qū)注射 PCPA可降低脊髓背角5-HT含量。
　　3.RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用參與大鼠骨癌痛的機制研究
　　方法:實驗一:雌

8、性 SD大鼠48只,隨機分為4組,每組12只。1)Sham-DMSO組:假手術后第14天 RVM區(qū)注射 DMSO(1μl);2)Sham-SB203580:假手術后第14天 RVM區(qū)注射 SB203580(50μg);3)CIBP-DMSO組:造模后第14天 RVM區(qū)注射 DMSO(1μl);4)CIBP-SB203580組:造模后第14天 RVM區(qū)注射 SB203580(50μg)。檢測各組大鼠不同時點的痛閾。免疫印跡法檢測 RVM區(qū)

9、給藥后 TPH的表達。高效液相色譜法分析 RVM區(qū)給藥后脊髓背角5-HT含量。應用免疫熒光染色法分別檢測 RVM區(qū) TPH和脊髓背角5-HT的表達。實驗二:雌性 SD大鼠12只,隨機分為2組:正常對照組(Naive組,n=3)和骨癌痛組(CIBP組,n=9)。分別于模型構建后第7、14和21d處死大鼠,取脊髓腰膨大組織進行基因芯片檢測5-HT受體的表達。
　　結果:骨癌痛大鼠RVM區(qū)注射 p38MAPK選擇性抑制劑 SB20358

10、0后機械縮爪閾值顯著升高,縮爪持續(xù)時間明顯縮短且移動誘發(fā)痛評分顯著降低(P<0.05)。免疫蛋白印跡檢測發(fā)現,RVM區(qū)注射 SB203580在產生鎮(zhèn)痛作用的同時顯著抑制了RVM區(qū)色氨酸羥化酶(TPH)的蛋白表達(P<0.05)。免疫熒光染色顯示 RVM區(qū)注射SB203580后 RVM區(qū) TPH染色陽性神經元減少。高效液相色譜分析結果顯示脊髓背角5-HT的水平降低(P<0.05)?；蛐酒Y果顯示,骨癌痛大鼠脊髓中參與5-HT易化疼痛作用

11、和抑制疼痛作用的受體表達均上調,但參與易化作用的受體表達高于抑制作用的受體。
　　4.RVM區(qū)膠質細胞活化參與大鼠骨癌痛的機制研究
　　方法:雌性 SD大鼠99只,隨機分為7組:1)正常對照組(Na?ve,n=6):不做任何處理;2)假手術組(Sham,n=18):于右后肢脛骨上段骨髓腔注射 D-hank’s液10μl;3)骨癌痛組(CIBP,n=18):于右后肢脛骨上段骨髓腔注射 walker256乳腺癌細胞懸液10μl(

12、3×104個);4)假手術加生理鹽水組(sham/NS,n=15):假手術后第10天RVM注射生理鹽水0.5μl;5)骨癌痛加生理鹽水組(CIBP/NS,n=15):骨癌痛造模后第10天 RVM注射生理鹽水0.5μl;6)骨癌痛加米諾環(huán)素組(CIBP/ Minocycline,n=15):骨癌痛造模后第10天 RVM注射小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素0.5μl(25μg);7)骨癌痛加氟代檸檬酸組(CIBP/ Fluorocitrate,n=

13、12):骨癌痛模型構建后第10天 RVM注射星形膠質細胞抑制劑氟代檸檬酸1μg。應用影像學方法檢測骨癌痛大鼠脛骨骨質的破壞情況。熒光定量 PCR法檢測 RVM區(qū)膠質細胞活化標志物 mRNA表達的變化。Western-blot和免疫熒光染色檢測不同藥物處理對 RVM膠質細胞活化的影響。痛覺行為學檢測不同藥物處理后大鼠痛閾的改變。熒光定量 PCR法檢測 RVM給予小膠質細胞抑制劑后促炎性介質 IL-1β、IL-6、TNF-α和腦源性神經營養(yǎng)

14、因子(BDNF)的表達。
　　結果:骨癌痛大鼠RVM區(qū)小膠質細胞和星形膠質細胞顯著活化,且小膠質細胞釋放的促炎性介質 IL-1β、IL-6、TNF-α和BDNF表達升高(P<0.05)。RVM區(qū)注射小膠質細胞抑制劑和星形膠質細胞抑制劑可分別抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化,并能呈時間依賴性的緩解骨癌痛大鼠的疼痛。RVM區(qū)注射小膠質細胞抑制劑可逆轉小膠質細胞釋放的促炎性介質的高表達,并能有效地緩解骨癌痛大鼠的疼痛。
　　5統(tǒng)

15、計學處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,計量資料以均數±標準差( x±s)表示;兩組數據之間比較采用t檢驗,多組數據之間比較采用方差分析(ANOVA),分析后post-hoc檢驗采用Student-Newman–Keuls test,脊髓背角5-HT含量與機械痛閾進行雙變量相關分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結論：
　　1.RVM區(qū)5-羥色胺能下行易化作用參與了大鼠骨癌痛的維持，其機制包