凋亡相關蛋白POTE在晚期非小細胞肺癌順鉑耐藥中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一。在我國，肺癌的發(fā)病率在逐年上升，并且已經成為我國城市人口癌癥死亡的主要原因。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要病理類型，占80%左右。由于早期肺癌缺乏特異性癥狀，65%-70%的NSCLC患者確診時已處于晚期，失去手術治療的機會。晚期肺癌治療一般采取多學科綜合治療，其中化療是最重要手段之一。自80年代以來，隨

2、著第三代化療藥物不斷涌現(xiàn)，以鉑類為基礎聯(lián)合第三代化療新藥的方案成為晚期NSCLC的標準化療(Standard Chemotherapy, SC)方案，但其化療的有效率(Response Rate, RR)僅為30%-40%，NSCLC的5年生存率僅為15%。而造成化療失敗的主要原因是耐藥。
　　一直以來，順鉑被認為是晚期NSCLC化療的基石，幾乎所有一線NSCLC化療方案都是與順鉑聯(lián)合應用的方案。順鉑的抗癌作用機制是藥物進入腫瘤細

3、胞后，與DNA交叉連接，形成穩(wěn)定的順鉑-DNA復合物，阻斷DNA復制，導致腫瘤細胞死亡。當前認為導致順鉑耐藥的機制包括腫瘤細胞內藥物濃度降低、藥物在細胞內被降解代謝以及DNA損傷修復增強。除此之外，還包括凋亡信號轉導通路的改變。順鉑抗腫瘤作用的主要機制是誘導腫瘤細胞凋亡。體內外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞凋亡發(fā)生改變主要由于細胞凋亡信號轉導通路異常，凋亡相關因子表達異常引起。
　　POTE基因家族是靈長類生物所特有的，包含13個高度同源的基

4、因亞型，分別位于8條不同的染色體上。在多種腫瘤組織（前列腺癌，結腸癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和胰腺癌）及生殖細胞中表達，但在正常組織中不表達。在腫瘤組織中高表達的主要亞型是POTE-2γ和POTE-2α。目前POTE的功能尚不明確。有研究在Hela細胞及精子細胞中發(fā)現(xiàn)，POTE可能與Fas/FasL、BAK、Casepase-3等凋亡相關蛋白相互作用，與凋亡信號相關。本實驗室前期運用二維凝膠電泳及質譜分析的方法，在A549（人肺腺癌細胞珠

5、）和A549/DDP（順鉑誘導的耐藥細胞株）中分析差異性蛋白時發(fā)現(xiàn)：POTE蛋白在A549/DDP細胞株中表達明顯低于A549細胞。本研究旨在篩選出在A549細胞中起主導作用的POTE亞型，并分析其在A549細胞和A549/DDP細胞中的表達差異。收集應用含鉑雙藥治療的臨床樣本（腫瘤組織），初步分析POTE表達變化與NSCLC患者化療療效之間的關系。本研究共分三部分進行：
　　第一部分:A549/DDP耐藥株建立及生物學行為鑒定<

6、br>　　【目的】
　　A549細胞株基礎上誘導的A549/DDP細胞株的建立及其生物學行為的鑒定。
　　【方法】
　　采用順鉑敏感人肺腺癌細胞株A549經順鉑誘導產生對順鉑耐藥的耐藥細胞株A549/DDP；MTT法檢測兩細胞株對順鉑的敏感性。
　　1.人肺腺癌敏感細胞株A549順鉑誘導產生耐藥的細胞株A549/DDP。
　　2. MMT法檢測結果顯示順鉑對A549和A549/DDP細胞的增殖均有抑制作用，

7、順鉑對A549和A549/DDP細胞的IC50值分別為5.6和42.6ug/ml，耐藥倍數(shù)為7.57倍。
　　【結論】
　　成功獲得了人非小細胞肺癌耐藥細胞株A549/DDP，明確耐藥細胞株的耐藥指數(shù)為7.57倍。
　　第二部分:POTE蛋白在A549細胞中主要的表達亞型及其在鉑類耐藥中的作用和機制
　　【目的】
　　本部分實驗旨在篩選出A549細胞中POTE主要表達的亞型，明確其在A549和A549/DD

8、P細胞中分子水平和蛋白水平的表達差異，探討POTE-2γ與凋亡相關因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）的關系。
　　【材料和方法】
　　1.運用Trizol提取A549細胞中的總RNA；
　　2.運用PCR產物克隆篩選的方法，篩選出62個菌落測序；
　　3.運用DNAstar軟件進行堿基比對；
　　4.應用蛋白印跡法(Western Blot, WB)驗證POTE-2γ在A549和A549/D

9、DP細胞中的表達差異；
　　5.運用蛋白印跡的方法分別檢測順鉑在不同時間和濃度梯度時，A549及A549/DDP兩細胞株中POTE-2γ及凋亡相關因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）表達量的變化；
　　6.構建慢病毒載體,感染 A549細胞，下調POTE-2γ表達，蛋白印跡檢測目標蛋白（Fas、Bax、Bak）表達變化。
　　【結果】
　　1.PCR克隆篩選出的62個菌落中，其中4個測序失敗，58個

10、完成測序。完成測序的58個序列通過堿基比對均為POTE-2γ。
　　2.慢病毒對A549細胞中POTE-2γ表達量的干擾效率約73.6%。
　　3.蛋白印跡法及免疫細胞化學驗證結果顯示POTE-2γ在A549及A549/DDP兩細胞株間存在表達差異。
　　4.蛋白印跡結果顯示順鉑在不同時間和濃度梯度 POTE-2γ在 A549及 A549/DDP兩細胞株間存在表達差異。
　　5.在 A549細胞中下調 POTE-

11、2γ的表達，凋亡相關蛋白（Fas、Bax、Bak）表達的表達量也相應下調。
　　【結論】
　　1.在A549細胞中主要表達的POTE亞型是POTE-2γ。
　　2. POTE-2γ在A549細胞中的表達量明顯高于A549/DDP細胞。
　　3. POTE-2γ可能通過上調Fas等促凋亡因子，下調Bax，Bak等抗凋亡受體發(fā)揮促凋亡作用，而與順鉑耐藥相關。
　　第三部分:NSCLC患者組織中POTE-2γ表達

12、水平與含鉑雙藥化療療效的相關性
　　【目的】探討POTE-2γ表達與晚期NSCLC患者一線使用含鉑雙藥方案治療的療效的關系。
　　【材料和方法】
　　1.收集接受一線含鉑雙藥治療的晚期NSCLC患者的腫瘤組織；
　　2.采用Trizol法提取組織中的總RNA；
　　3.采用Fermentas RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉錄；
　　4.采用實時熒光

13、定量PCR檢測組織中POTE-2γ的表達量；
　　5.運用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。
　　【結果】
　　1. POTE-2γ高表達的患者一線使用含鉑雙藥方案的療效優(yōu)于低表達者，且與患者的性別相關（P=0.003）；
　　2. POTE-2γ高表達的患者TTP（Time To Progress）和OS（Over Servival）均長于POTE-2γ低表達的患者。
　　【結論】
　　POTE-2γ可能可以作