血管內(nèi)皮生長因子對血腫瘤屏障通透性的影響及作用機(jī)制初探.pdf

1、藥物通過血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)一般有兩種途徑：細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。根據(jù)藥物理化性質(zhì)，親水性藥物以細(xì)胞旁途徑為主，親脂性藥物以跨細(xì)胞途徑為主，并且跨細(xì)胞途徑能夠轉(zhuǎn)運與白蛋白大小相似或比其大的血漿蛋白。在正常血腦屏障和血腫瘤屏障(blood-Tumor barier，BTB)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microcapillary endothelial cells，BMECs)具有很低的胞吞轉(zhuǎn)運

2、功能，限制了許多大分子和顆粒性藥物進(jìn)入腦組織和腫瘤組織。如何增加BMECs的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運是增加化療藥物進(jìn)入腫瘤組織，提高化療療效的關(guān)鍵。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、血管生成的有絲分裂原，屬于生長因子家族，作為最強的血管通透性因子，其增加血管通透性的作用比組胺強50000倍。有研究表明，向局灶性腦缺血組織注射VEGF后血腦屏障通透性增加。

3、通過對內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，VEGF通過細(xì)胞質(zhì)膜微囊(caveolae)發(fā)揮作用。Caveolae是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，是第一個被確定的內(nèi)皮細(xì)胞胞吞成分，他的主要功能是通過細(xì)胞質(zhì)膜的跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運大分子物質(zhì)或內(nèi)化小分子物質(zhì)。VEGF能與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的caveolae結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成一些允許生物大分子通過的“小孔”，促進(jìn)生物分子的跨膜轉(zhuǎn)運，以此增加血管通透性。但是VEGF能否通過增加跨內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡的數(shù)量增加BTB的

4、通透性及其作用機(jī)制目前尚不明確。 本研究首先建立大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型，通過立體定位儀向腫瘤局部注射適當(dāng)劑量VEGF，應(yīng)用伊文氏蘭(evans blue，EB)的滲透評估VEGF作用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性的變化，透射電鏡觀察血腫瘤屏障BMECs中吞飲小泡數(shù)量的變化，明確VEGF對血腫瘤屏障通透性的影響；并檢測質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2在腦腫瘤組織微血管中的分布和表達(dá)情況，初步明確VEGF開

5、放血腫瘤屏障的機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新途徑。 方法: 1、大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和C6腦膠質(zhì)瘤模型的制備。 2、應(yīng)用伊文氏蘭的滲透評估VEGF作用前后C6腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性的變化。 3、應(yīng)用透射電鏡技術(shù)檢測C6腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障BMECs中吞飲小泡數(shù)量的變化。 4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測VEGF作用前后C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織微血管中caveolin—1和c

6、aveolin—2的分布和表達(dá)水平變化。 5、應(yīng)用western blot法檢測VEGF作用前后C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織微血管中caveolin—1和caveolin—2的蛋白表達(dá)水平變化。 結(jié)果: 1、成功建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型。 2、分別給予劑量為0.01 ng/g、0.05 ng/g、0.1 ng/g、0.2 ng/g和0.4 ng/g的VEGF，當(dāng)VEGF劑量為0.05 ng/g時，C6腦膠

7、質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性顯著增加。 3、給予0.05 ng/g VEGF后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性增加，在VEGF作用45 min時增加最顯著，以后逐漸恢復(fù)，在VEGF作用120 min時恢復(fù)到未給藥時水平。 4、C6腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障BMECs中吞飲小泡的數(shù)量很少，給予0.05 ng/gVEGF作用45 min時，吞飲小泡數(shù)量明顯增加，在VEGF作用120 min時明顯減少。 5、給予0.05 n

8、g/g VEGF后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織微血管中caveolin—1和caveolin—2的蛋白表達(dá)水平增加，二者均在VEGF作用45 min時達(dá)峰值，以后逐漸降低，在VEGF作用120 min時降到給藥前水平。 討論: 我們的研究證明，VEGF作用后C6腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB的通透性顯著增加，BMECs中吞飲小泡的數(shù)量明顯增加。同時發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的表達(dá)水平顯著高于對照

9、組，在VEGF作用45 min時達(dá)峰值。上述結(jié)果說明，VEGF能夠通過增加吞飲小泡數(shù)量的跨細(xì)胞途徑增加BTB的通透性。 血管內(nèi)皮生長因子是首先被描述為來源于腫瘤具有很強的增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性的細(xì)胞因子，它是目前已知作用最強的促血管生成因子。許多研究表明適當(dāng)劑量的VEGF能夠有效地增加BBB和BTB的通透性。我們應(yīng)用伊文氏蘭的滲透評估BTB的通透性變化時發(fā)現(xiàn)，VEGF劑量為0.05 ng/g時，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB的通透性顯著增加

10、；并且在VEGF作用45 min時達(dá)峰值，以后逐漸恢復(fù)，在VEGF作用120 min時恢復(fù)到未給藥時水平。許多研究者的研究結(jié)果與我們的結(jié)果相一致。但是關(guān)于VEGF究竟是通過細(xì)胞旁途徑還是跨細(xì)胞途徑增加BTB的通透性目前還不是很清楚。研究認(rèn)為，VEGF可選擇性直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，通過介導(dǎo)形成跨細(xì)胞間隙、小泡囊狀細(xì)胞器(vesicular vacuolar organelle，VVO)和窗孔調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性

11、，從而增加BTB的通透性。大分子物質(zhì)可在VEGF的作用下，通過細(xì)胞質(zhì)膜微囊細(xì)胞器進(jìn)行轉(zhuǎn)運。我們應(yīng)用透射電鏡觀察VEGF對C6腦膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障超微結(jié)構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)，C6膠質(zhì)瘤移植大鼠血腫瘤屏障BMECs中吞飲小泡的數(shù)量很少，給予0.05 ng/g VEGF作用45min時，吞飲小泡的數(shù)量明顯增加，在VEGF作用120 min時明顯減少。 有研究證明，VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞吞飲小泡和窗孔形成有關(guān)，但是其介導(dǎo)吞飲小泡和窗孔形成和

12、保持的機(jī)制尚未明了?？缂?xì)胞途徑主要通過細(xì)胞表面的caveolae介導(dǎo)的囊泡載體的內(nèi)吞過程實現(xiàn)的，特定的信號可引起caveolae的內(nèi)吞，并轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞的基膜側(cè)。Caveolin—1是形成caveolae所必需的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在調(diào)節(jié)囊泡運輸中起重要作用，它可以通過控制信號分子的活性和定位調(diào)節(jié)囊泡的分裂、內(nèi)吞、融合和胞吐作用。為了進(jìn)一步弄清VEGF增加吞飲小泡數(shù)量的機(jī)制，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)和western blot等方法檢測了VEGF作

13、用前后caveolin—1和caveolin—2的分布和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，VEGF作用后caveolin—1和caveolin—2在C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織微血管中的表達(dá)水平增加，二者均在VEGF作用45 min時達(dá)峰值，以后逐漸降低，在VEGF作用120 min時降到給藥前水平。由此我們認(rèn)為，VEGF可能通過上調(diào)caveolin—1和caveolin—2的表達(dá)增加吞飲小泡的數(shù)量，從而增加血腫瘤屏障的通透性。 上述

14、結(jié)果證明，VEGF作用后血腫瘤屏障通透性和吞飲小泡數(shù)量增加，同時質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的表達(dá)水平上調(diào)。我們首次在分子水平上證明，VEGF能夠通過增加吞飲小泡數(shù)量的跨細(xì)胞途徑增加血腫瘤屏障的通透性。但是，VEGF上調(diào)caveolin—1和caveolin—2的信號機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 結(jié)論: 1、VEGF顯著增加血腫瘤屏障的通透性，同時增加血腫瘤屏障BMECs中吞飲小泡的數(shù)量。