液相-SELEX方法的建立及變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)特異適配體的篩選.pdf

1、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GTF)是變形鏈球菌合成的重要致齲因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在內(nèi)的多種胞外多糖。GTF結(jié)構(gòu)包括催化區(qū)(Catalytic，CAT)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(Glucan binding，GB或GLU)兩個(gè)功能區(qū)段，其中催化區(qū)(CAT)是它的重要功能區(qū)段。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先利用基因工程的方法在大腸桿菌中分別誘導(dǎo)表達(dá)了帶NusA的rNusA-CAT融合蛋白和NusA對(duì)照蛋白。菌體經(jīng)超聲破

2、碎后，重組蛋白存在于菌體超聲上清液中。利用載體上C端的His標(biāo)簽對(duì)重組蛋白進(jìn)行了金屬螯合層析純化。蒽酮-硫酸法證明重組rNusA-CAT蛋白具有良好的催化活性。
　　 由于傳統(tǒng)SELEX技術(shù)篩選靶分子時(shí)，首先需要將靶分子進(jìn)行純化和固定，因而以天然構(gòu)象存在于液相中的非純化靶蛋白不能通過(guò)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行篩選。為解決這一問(wèn)題，本研究將凝膠阻滯(EMSA)的基本原理引入消減SELEX篩選過(guò)程，初步建立了一種基于凝膠阻滯的新篩選方法，實(shí)現(xiàn)了

3、非純化靶標(biāo)蛋白的液相篩選(液相-SELEX技術(shù))。實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)為35個(gè)堿基、全長(zhǎng)78nt的ssDNA文庫(kù)，以表達(dá)rNusA-CAT蛋白的未純化上清為目的靶，以表達(dá)NusA蛋白的未純化上清為消減靶，利用液相-SELEX技術(shù)進(jìn)行了十輪的篩選。放射性同位素檢測(cè)發(fā)現(xiàn)；隨著篩選輪次的增加，ssDNA文庫(kù)逐漸富集，富集的ssDNA配基可特異的識(shí)別rNusA-CAT蛋白，而不識(shí)別NusA蛋白。該結(jié)果的取得為今后GTF功能抑制劑的獲得和齲齒病防治奠定