肝臟干細胞向胰腺β細胞分化的研究.pdf

1、目前，糖尿病已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。根據(jù)胰島素分泌的絕對和相對不足可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，其中Ⅰ型糖尿病的發(fā)病本質(zhì)是產(chǎn)生胰島素的胰島β細胞被破壞所致。雖然臨床上通過給患者服用降糖藥或注射胰島素可將患者的血糖控制在正常范圍內(nèi)，但這些治療措施不能有效預防糖尿病所致的各種晚期并發(fā)癥。近年來，胰腺或胰島細胞移植被認為是根治糖尿病的最好療法，但移植后的免疫排斥反應和供體的嚴重缺乏等問題限制了該療法的實際應用。如今，隨著對干細胞誘導分

2、化和成體細胞轉(zhuǎn)分化研究的深入，通過誘導分化或轉(zhuǎn)分化獲得可用于移植的胰島素分泌細胞己成為糖尿病治療研究的一個新的熱點。 研究表明通過強制表達某些組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，可使一種組織類型的細胞轉(zhuǎn)分化為另一種組織類型的細胞。在個體發(fā)育過程中，肝臟和胰腺都起源于前腸末端，發(fā)育上的同源性提示肝臟和胰腺在細胞增殖和分化調(diào)控等方面有很高的相似性。因此，人們推測肝臟來源的細胞可能會更容易的轉(zhuǎn)分化為胰腺β細胞。目前已有證據(jù)表明，有些胰腺發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄

3、因子(如Pdx1、NeuroD、Pax4、MafA等)可將肝原始細胞、成熟的肝細胞，甚至肝腫瘤細胞誘導分化為可分泌胰島素的胰腺β細胞樣細胞。這些研究成果一方面有望緩解糖尿病細胞治療的細胞來源問題，另一方面也為糖尿病治療提供了一個新的思路：即可在體內(nèi)利用患者的肝干細胞或肝細胞的胰向分化來實現(xiàn)治療目的。 然而，目前人們還沒有建立高效的、特異的誘導肝臟細胞向胰島素分泌細胞轉(zhuǎn)分化的技術體系。為此，本研究通過PCR的方法成功克隆了人胰腺轉(zhuǎn)

4、錄因子Pdx1、Pax4、NeuroD和MafA基因，并將其插入到pAd-track-CMV穿梭載體中，然后在AdEasier-1細胞中重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒，繼而在293LP細胞中包裝出感染性重組腺病毒。重組腺病毒以復合感染(multiplicity of infection，M．O．I)指數(shù)為20感染人胎肝干細胞(human fetal liver stem cells，hFLSCs)，24小時后，熒光顯微鏡下觀察顯示幾乎所有的細胞

5、都表達報告基因GFP，RT-PCR和Western Blot檢測顯示外源基因在人胎肝干細胞中可轉(zhuǎn)錄和翻譯。進一步將重組腺病毒懸液經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)6天后，小鼠肝臟幾乎所有的細胞都表達了GFP報告基因。這些結(jié)果表明，本研究已成功構(gòu)建了胰腺轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、Pax4、NeuroD、MafA的腺病毒表達載體，這為肝干細胞向胰腺β細胞分化或在小鼠肝臟中建立分泌胰島素的細胞群的研究準備了條件。在此基礎上，為了建立肝干細胞高效特異的向胰腺β細胞轉(zhuǎn)