高尿酸誘導(dǎo)血管鈣化的機(jī)制研究.pdf

1、背景：尿酸（UA）是嘌呤代謝產(chǎn)物。人類在進(jìn)化的過(guò)程當(dāng)中，由于尿酸酶的基因發(fā)生變異，致使其功能失活，使得人血UA濃度顯著高于其它哺乳類動(dòng)物。近年來(lái)，大量的臨床調(diào)查及循證實(shí)踐證實(shí)高尿酸血癥（HUA）是心腦血管系統(tǒng)疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。血管鈣化（VC）可導(dǎo)致血管脆性及僵硬度增加，增添了動(dòng)脈斑塊、血管破裂及動(dòng)脈瘤形成的危險(xiǎn)性，是導(dǎo)致心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管事件的重要危險(xiǎn)因子。高尿酸是否通過(guò)誘導(dǎo)血管鈣化參與動(dòng)脈硬化的發(fā)生和發(fā)展，從而誘發(fā)各種心血管疾

2、病值得探討。血管鈣化與血管壁細(xì)胞，尤其是血管的平滑肌細(xì)胞在各類刺激因素作用下活化，轉(zhuǎn)化成為成骨樣細(xì)胞密切相關(guān)。大量研究證實(shí)UA可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖及氧化應(yīng)激。高尿酸是否通過(guò)誘導(dǎo)VSMC分化成為成骨樣細(xì)胞，從而導(dǎo)致VC目前尚不清楚，對(duì)其進(jìn)行深入研究，勢(shì)在必行。前期工作中，課題組在國(guó)際上首次在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥導(dǎo)致以早期出現(xiàn)彌漫性血管鈣化為特征的動(dòng)脈硬化的直接證據(jù)。基于該發(fā)現(xiàn)，本課題擬對(duì)高尿酸血癥導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的機(jī)制進(jìn)

3、行研究。
　　第一部分尿酸誘導(dǎo)大鼠原代平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化
　　目的：探討尿酸是否可以在一般培養(yǎng)環(huán)境中刺激血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　方法：分離、培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白鑒定VSMC。
　?。?）含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞24h，48h和72h后，CCK-8法檢測(cè)U

4、A對(duì)VSMC增殖的影響。
　?。?）含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，分別作用3天，7天，14天，每3天換液一次。采用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒微量酶標(biāo)法測(cè)定培養(yǎng)液中的ALP活性，并通過(guò)細(xì)胞蛋白定量計(jì)算相應(yīng)的ALP活性值。
　　（3）將大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol

5、/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA，Real-Time PCR（RT-PCR）檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物Runx2、BMP-2、OPN mRNA水平變化及平滑肌表型標(biāo)志物SM22αmRNA水平變化。
　?。?）將大鼠VS

6、MC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）法檢測(cè)細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）血管平滑肌細(xì)胞在尿酸濃度200μmol/L及400μmol/L作用下，細(xì)胞增殖，且呈濃度與時(shí)間依賴性。尿酸濃度在800μmol/L時(shí)，其增殖作用相比400μmol/L有減弱趨勢(shì)。
　　（2）尿酸

7、濃度為800μmol/L時(shí)，在作用7天和14天時(shí)ALP活性明顯增強(qiáng)，且隨著時(shí)間增加，其增加效果越明顯。但UA200μmol/L和400μmol/L，ALP活性隨作用時(shí)間增加趨勢(shì)不明顯。
　?。?）茜素紅染色未見(jiàn)顯著礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)。
　?。?）成骨樣標(biāo)志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA水平在尿酸濃度800μmol/L明顯增高。平滑肌表型標(biāo)志物SM22α各組見(jiàn)未有明顯差異。
　　（5）尿酸800μmol/L時(shí)，Ru

8、nx2蛋白表達(dá)明顯增高，其他濃度Runx2表達(dá)增高不明顯。
　　結(jié)論：尿酸可誘導(dǎo)VSMC增殖，高濃度尿酸可誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞標(biāo)志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA表達(dá)，提示尿酸有誘導(dǎo)大鼠原代胸主動(dòng)脈VSMC向成骨樣細(xì)胞分化的趨勢(shì)。
　　第二部分尿酸促進(jìn)大鼠原代胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化及礦化
　　目的：探討在成骨誘導(dǎo)劑存在的前提下，尿酸促進(jìn)VSMC成骨樣分化及礦化的能力。
　　方法：
　?。?）

9、含不同濃度尿酸（0，200，400和800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞24h，48h和72h后，CCK-8檢測(cè)尿酸對(duì)VSMC增殖的影響。（2）尿酸濃度0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，作用14天，ALP試劑盒檢測(cè)相應(yīng)的ALP活性。
　　（3）將大鼠VSMC接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol

10、/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用Von Kossa染色試劑盒進(jìn)行鈣鹽沉積染色。
　?。?）將大鼠VSMC接種于24孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天，用茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色并進(jìn)行定量鈣鹽分析。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μ

11、mol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA，Real-Time PCR檢測(cè)檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物Runx2、BMP-2、OPNmRNA水平變化及平滑肌表型標(biāo)志物SM22αmRNA水平變化。
　?。?）將大鼠VSMC接種于6孔板，在含不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白

12、，Western Blotting方法檢測(cè)細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）VSMC在尿酸濃度200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L聯(lián)合成骨誘導(dǎo)劑作用下，細(xì)胞增殖，且呈濃度與時(shí)間依賴性。
　　（2）尿酸作用于VSMC后ALP活性在尿酸濃度為400μmol/L、800μmol/L時(shí)明顯增高，且呈濃度依賴性增長(zhǎng)。
　?。?）Von Kossa染色結(jié)果顯示，各組均有鈣鹽沉積，肉眼可見(jiàn)有

13、尿酸（200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑組較對(duì)照組顏色稍深。
　　（4）茜素紅染色各組均有染色陽(yáng)性的橘黃色沉淀，肉眼觀察UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組染色最明顯。定量分析結(jié)果可見(jiàn)鈣鹽沉積呈尿酸濃度依賴性增長(zhǎng)。
　　（5）成骨樣細(xì)胞標(biāo)志物Runx2，BMP-2，OPN的mRNA表達(dá)在尿酸濃度400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑明顯增高，且呈濃度依賴性。平滑肌

14、表型標(biāo)志物SM22α在800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組較對(duì)照組明顯減少。
　　（6）尿酸400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組，800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組，Runx2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論：在成骨誘導(dǎo)劑存在時(shí)，高濃度尿酸可明顯促進(jìn)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化及礦化。
　　第三部分尿酸通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化
　　目的：探討尿酸

15、促進(jìn)大鼠VSMC細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）VSMC在不同濃度尿酸（0μmol/L，200μmol/L，400μmol/L，800μmol/L）+成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，48h后，進(jìn)行ROS熒光探針-DHE染色及DAPI核染色。
　　（2）實(shí)驗(yàn)分組 UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，U

16、A800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014。連續(xù)培養(yǎng)14天，測(cè)相應(yīng)的ALP活性。
　?。?）將大鼠 VSMC接種于6孔板。分組：UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014，連續(xù)

17、培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總RNA，Real-Time PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞骨樣標(biāo)志物mRNA水平變化。
　　（4）將大鼠 VSMC接種于6孔板。分組：UA0μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA200μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA400μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk-1，UA800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+CHIR98014，連續(xù)培養(yǎng)14天。提取細(xì)胞總蛋白，Western

18、 Blotting法檢測(cè)細(xì)胞β-catenin，Runx2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）DHE染色結(jié)果顯示，隨著尿酸濃度增加，VSMC內(nèi)紅色熒光亮度逐漸增強(qiáng)，提示尿酸可誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROS生成，且其促進(jìn)作用呈濃度依賴性。尿酸作用24h，48h，DHE染色隨時(shí)間同樣濃度有加深，呈時(shí)間依賴性。
　　（2）尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后，ALP活性明顯降低，尿酸80

19、0μmol/L加入Wnt/β-catenin通路激活劑CHIR后，ALP活性略有升高。
　?。?）尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑在加入Wnt/β-catenin通路抑制劑Dkk-1后，Runx2、BMP-2、OPN的mRNA表達(dá)較單純尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑組均明顯降低。
　　（4）尿酸800μmol/L+成骨誘導(dǎo)劑+Dkk1組抑制了平滑肌細(xì)胞β-catenin，Runx2蛋白表達(dá)，而尿酸800μmol/L+成