黃芪甲苷對高胰島素誘導人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　在體外，觀察不同濃度胰島素（insulin，INS）對人腎小球系膜細胞（human mesangial cells,HMCs）細胞增殖的影響，研究黃芪甲苷（astragalosides IV,As-IV）對高胰島素環(huán)境中HMCs的損傷是否具有保護作用，探討高胰島素對糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）發(fā)生發(fā)展與As-IV防治HMCs損傷的可能作用機制，從而為臨床上防治DN及As-IV的應用提供依

2、據。
　　方法：
　　1.將常規(guī)復蘇的HMCs用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于含5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化，進行后續(xù)實驗。
　　2.將HMCs隨機分組如下：（1）正常組（NG）、胰島素組（INS，分別含1，2，4，8，16，32，64，128 nmol/L胰島素）；（2）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、Tem

3、pol（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（6.25，12.5，25，50，100μmol/L）組；（3）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、Tempol（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組；（4）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、Tempol

4、（100μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組；（5）正常組（NG）、高胰島素（HINS，64 nmol/L）組、DPI（10μmol/L）組、LY294002（10μmol/L）組與As-IV（25，50，100μmol/L）組，分別進行相應實驗操作。
　　3. MTT比色法檢測2（1）分組中不同濃度INS作用不同時間后對HMCs細胞增殖的影響，根據結果，篩選IN

5、S的最佳作用濃度和時間進行后續(xù)實驗。按2（2）分組，仍采用MTT比色法，檢測各用藥組對高胰島素誘導的HMCs細胞增殖的作用情況，同時篩選As-IV的最佳用藥濃度。
　　4.采用ELISA法檢測2（3）分組中各組細胞上清液中纖維連結蛋白（fibronectin，FN）、基質金屬蛋白酶組織抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、基質金屬蛋白酶-9（matrix met

6、alloproteinase-9，MMP-9）的含量。同時采用二氫二氯熒光素（DCFH-DA）法檢測2（4）分組中各組細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量；Western blot法分別檢測2（5）分組中NADPH氧化酶4（NADPH oxidase4，NOX4）和2（3）分組中磷酸化蛋白激酶B（phosphor-protein kinase b，p-PKB，又稱p-Akt）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素

7、靶蛋白（phosphor-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）蛋白表達的變化。
　　結果:
　　1. MTT結果顯示，隨著作用時間的延長和濃度的增加，INS對 HMCs的促增殖作用不斷增強，具有時效與量效關系；與正常組比較，高胰島素組細胞增殖顯著增加（P＜0.01），與高胰島素組比較，DPI、Tempol、LY294002及As-IV（6.25，12.5，25，50，100μmol/L）

8、組對高胰島素誘導的HMCs細胞增殖均有不同程度的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。且As-IV對 HMCs的抑制作用隨著用藥濃度的增加不斷增強，其中，As-IV（25，50，100μmol/L）組的抑制作用有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2. ELISA結果顯示，與正常組比較，高胰島素組HMCs細胞上清液中FN、MMP-9、TIMP-1含量上升，MMP-9/TIMP-1比值下降（P＜0.01）。與高胰島素組

9、比較，Tempol、LY294002及As-IV（25，50，100μmol/L）組均能改善高胰島素誘導的FN、MMP-9、TIMP-1的異常分泌（P＜0.05，P＜0.01），且As-IV對以上三種蛋白分泌及MMP-9/TIMP-1比值的影響呈濃度依賴性，表明As-IV在調控INS對體外培養(yǎng)的 HMCs的細胞增殖具有促進作用，且在一定范圍內呈時間和濃度依賴性；而As-IV對高胰島素誘導的HMCs損傷具有保護作用，且在實驗范圍內呈濃度依

10、賴性，其發(fā)揮保護作用的機制可能與As-IV具有抑制細胞增殖、NOX4蛋白表達和Akt、mTOR蛋白磷酸化，改善FN、MMP-9、TIMP-1的異常分泌，緩解細胞氧化應激狀態(tài)的功能有關。
　　結論:INS對體外培養(yǎng)的HMCs的細胞增殖具有促進作用，且在一定范圍內呈時間和濃度依賴性；而As-IV對高胰島素誘導的HMCs損傷具有保護作用，且在實驗范圍內呈濃度依賴性，其發(fā)揮保護作用的機制可能與As-IV具有抑制細胞增殖、NOX4蛋白表達和