核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)效應(yīng)調(diào)控因子RRG-1和RRG-2的生物學(xué)功能研究.pdf

1、油菜菌核病是一種世界性病害，其病原為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在我國(guó)，該病菌寄主范圍非常廣泛，能侵染包括75科278屬400余種植物。目前，油菜菌核病的防治主要以化學(xué)防治為主?？┚孀鳛橐环N新型的苯吡咯類殺菌劑對(duì)油菜菌核病具有良好的防效，但該藥劑在我國(guó)油菜菌核病的防治上尚未進(jìn)行登記，同時(shí)，咯菌腈對(duì)核盤菌的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，咯菌腈對(duì)核盤菌的作用機(jī)制與核盤菌的雙組分信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)，而RR

2、G-1和RRG-2是雙組分信號(hào)系統(tǒng)中兩個(gè)重要的效應(yīng)調(diào)控因子。因此，本文首先系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質(zhì)體的制備與PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系;然后，利用該體系分別構(gòu)建了基因敲除突變體及其回復(fù)突變體來(lái)研究RRG-1和RRG-2的生物學(xué)功能，進(jìn)一步明確RRG-1和RRG-2對(duì)咯菌腈敏感性的調(diào)控機(jī)制。該研究將對(duì)油菜菌核病的綜合防控、研發(fā)原創(chuàng)性殺菌劑具有重要意義。
　　1.本文系統(tǒng)優(yōu)化了核盤菌原生質(zhì)體的制備條件及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系。經(jīng)

3、優(yōu)化，確定制備原生質(zhì)體的最佳條件為:在25℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中用YEPD液體培養(yǎng)基175 r/min震蕩培養(yǎng)出發(fā)菌株36 h;先用滅菌紗布過(guò)濾，滅菌水沖洗2次，再用緩沖液Ⅲ（0.8 M甘露醇的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）沖洗2次，轉(zhuǎn)移到含有10mL1.5％酶解液（裂解酶L）的小三角瓶中，30℃85 r/min酶解2.5 h;1200 r/min離心5min收集原生質(zhì)體，用緩沖液Ⅲ重懸浮，1200 r/min離心5 min; STC重懸浮，12

4、00r/min離心5 min;再用STC重懸浮至原生質(zhì)體濃度約為108個(gè)/μL;取80μL原生質(zhì)體懸浮液于轉(zhuǎn)化管中，再加入20μL PTC，冰上放置待用。將含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPH）的片段轉(zhuǎn)化到核盤菌原生質(zhì)體后，經(jīng)100μg/mL潮霉素B篩選轉(zhuǎn)化子。
　　2.雙組分信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控滲透壓和氧化脅迫、菌絲生長(zhǎng)、致病性和殺菌劑抗性等生物學(xué)功能。本文利用上述建立的PEG介導(dǎo)的核盤菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)核盤菌雙組分信號(hào)傳導(dǎo)

5、途徑兩個(gè)效應(yīng)調(diào)控因子SsRRG-1和SsRRG-2進(jìn)行基因敲除及回復(fù)驗(yàn)證，并對(duì)其生物學(xué)表型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:與親本菌株相比，SsRRG-1基因敲除突變體對(duì)SDS、高糖滲透壓、過(guò)氧化氫產(chǎn)生的氧化脅迫以及對(duì)咯菌腈的敏感性顯著增加，菌絲生長(zhǎng)速率顯著降低，菌絲分支增多;致病力顯著下降，細(xì)胞膜透性增大，菌核變小且數(shù)量增多，SsRRG-1基因敲除突變體胞內(nèi)甘油含量及對(duì)不同金屬離子脅迫的敏感性無(wú)顯著性差異。SsRRG-1基因回復(fù)突變體的上述表型與

6、親本菌株差異不顯著。
　　與親本菌株相比，SsRRG-2基因敲除突變體對(duì)咯菌腈的敏感性降低，對(duì)高鹽滲透壓、過(guò)氧化氫產(chǎn)生的氧化壓、SDS、剛果紅和Caffine敏感性增加;草酸及胞內(nèi)甘油含量減少，菌絲頂端扭曲，致病力顯著下降，細(xì)胞膜透性增大，不能形成正常的菌核;對(duì)不同金屬離子脅迫的敏感度也存在一定差異;qRT-PCR結(jié)果表明，SsRRG-2基因敲除后，雙組分信號(hào)系統(tǒng)中的下游關(guān)鍵激酶基因SsOS4、SsOS5表達(dá)量增加，SsHog1表