HIF-1對心肌細胞缺氧-復氧損傷的保護作用的初步探討.pdf

1、目的：觀察缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α)的活性與靶基因表達的變化，探討其對體外培養(yǎng)的心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)損傷的影響。 方法：取(1～3d)SD乳鼠心臟并分離培養(yǎng)成心肌細胞；觀察心肌細胞生長情況，分別以臺盼藍染色、免疫細胞化學染色檢測心肌細胞活力及鑒定其純度。于培養(yǎng)的第3天將心肌細胞隨機分為3組(每組重復6次)，包括：①正

2、常對照組，②缺氧/復氧(H/R)組，③甲基乙二?；拾彼?DMOG+H/R)組；建立缺氧/復氧損傷模型，以脯氨酸羥化酶的抑制劑—甲基乙二?；拾彼?DMOG)進行干預。觀察各組心肌細胞的搏動頻率；應用酶免疫法檢測各組心肌細胞培養(yǎng)上清中的肌鈣蛋白I(cTnI)含量；采用RT—PCR法檢測各組HIF-1α及下游因子血紅素氧合酶-1(HO-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT-1)mRNA水平；采用間接酶聯(lián)免疫吸附實

3、驗(ELISA)檢測各組心肌細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)的表達；進行脯氨酸羥化酶(P4HA2)小干擾RNA(siRNA)載體的構(gòu)建。 結(jié)果：分離1只乳鼠所獲得的心肌細胞產(chǎn)量約為140萬個，且心肌細胞活力為90％以上，純度達95％。培養(yǎng)4～6h的乳鼠心肌細胞開始貼壁生長，12～24h明顯增殖，3～4d后細胞融合成片；心肌細胞由圓形變?yōu)樗笮?、星形、多角形，并出現(xiàn)自

4、發(fā)性節(jié)律性搏動。與正常對照組相比，H/R組、DMOG+H/R組心肌細胞的搏動頻率均明顯減少(P<0.01)；而DMOG+H/R組心肌細胞的搏動頻率又較H/R組明顯升高(P<0.01)。與正常對照組相比，H/R組、DMOG+ H/R組的cTnI含量和ICAM-1表達水平明顯增高(P<0.01)，且HIF-1α、HO-1、VEGF、GLUT-1 mRNA水平亦明顯增高(P<0.01、P<0.05)。與H/R組相比，DMOG+H/R組心肌細胞

5、HIF-1α、HO-1、VEGF、GLUT1mRNA水平明顯增高，而cTnI含量和ICAM-1表達水平則明顯降低(P<0.05)。完成P4HA2siRNA慢病毒載體構(gòu)建。 結(jié)論：DMOG干預體外培養(yǎng)的心肌細胞可以使HIF-1在mRNA水平穩(wěn)定表達；HIF-1的穩(wěn)定表達可以促進下游靶基因HO-1、VEGF、GLUT1mRNA的表達；與H/R組相比，DMOG干預組心肌細胞的搏動頻率明顯升高且心肌細胞cTnI含量和ICAM-1含量有所