農桿菌誘導北柴胡毛狀根體系建立及UGT基因功能初步研究.pdf

1、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）是中藥柴胡的重要基源植物，柴胡皂苷是其主要藥效成分。糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase; UGT)是柴胡皂苷生物合成途徑的后修飾酶，其中后修飾作用是形成柴胡皂苷種類多樣性的主要因素。本研究對可能參與皂苷生物合成的BcUGT10基因進行功能驗證。一方面，以發(fā)根農桿菌為誘導菌株，建立北柴胡毛狀根誘導體系，進行發(fā)根農桿菌介導的北柴胡BcUGT10基因的遺傳轉化初步研

2、究。另一方面，構建BcUGT10基因原核表達載體，誘導其表達，利用重組酶蛋白進行體外酶活分析，探究BcUGT10基因的功能，為最終闡明柴胡皂苷生物合成途徑奠定基礎。具體研究結果如下:
　　1設計多種誘導條件，包括不同菌種種類、外植體類型、侵染方式和侵染時間等，探索建立穩(wěn)定的北柴胡毛狀根誘導體系。結果在采用發(fā)根農桿菌A4侵染北柴胡無菌苗葉基部，菌液浸染20 min，置于固體培養(yǎng)基（B5+乙酰丁香酮200μmol/L+蔗糖20g/L或

3、MS+NAA6 mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+蔗糖20 g/L）共培養(yǎng)3d后，轉入抑菌培養(yǎng)，10d左右發(fā)出毛狀根。由此建立了北柴胡毛狀根誘導體系。
　　2設置多種處理，包括3種培養(yǎng)基:B5、改良White和WPM，3種外源激素種類:IBA、IAA和NAA，真菌誘導子為黑曲霉誘導子，每組處理設計2～4個濃度梯度，培養(yǎng)三個月收獲稱重，測定其產量變化，HPLC方法檢測毛狀根柴胡皂苷含量。結果在添加0.5 mg/L IBA的B5

4、培養(yǎng)基中，毛狀根產量（干重）和柴胡皂苷產量最高，分別為2.4 g和9.05 mg。篩選出北柴胡毛狀根最適離體培養(yǎng)條件。
　　3以北柴胡毛狀根誘導體系為基礎，進行發(fā)根農桿菌介導的BcUGT10基因轉化北柴胡初步研究。誘導產生的毛狀根經25 mg/L潮霉素篩選獲得3條抗性毛狀根，PCR檢測后，未得到陽性轉化毛狀根。后續(xù)將重新侵染一批外植體，期望獲得轉基因毛狀根。
　　4通過擬南芥浸花法，進行根癌農桿菌介導的BcUGT10基因轉化