TWIST2在髓系白血病中抑癌基因功能研究.pdf

1、【研究目的】Twist蛋白是一種含有堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）結構的轉(zhuǎn)錄因子，在進化過程中高度保守，包括Twist1和Twist2。Twist1與Twist2的結構有66%的相似度，并且在bHLH區(qū)域相似度高達98%，但其功能并不一致。Twist蛋白在多種實體瘤中表現(xiàn)為潛在的致癌性，包括調(diào)控 AKT2的表達、促進細胞上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)的發(fā)生，在腫瘤細胞的遷移,侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用。Twist在血液系統(tǒng)疾病中的作用與實體瘤不同，在T

2、wist2-/-小鼠髓系細胞過度增殖，有骨髓增殖性疾?。∕PD）的表現(xiàn)，說明Twist2對小鼠骨髓粒系細胞生長呈負調(diào)節(jié)作用，故我們認為TWIST2在髓系白血病中可能起到抑癌基因的功能，為進一步驗證我們的假設，首次揭示TWIST2在髓系白血病中的作用，我們進行了一系列基礎研究，希望能為髓系白血病的治療提供新的思路。
　　【研究方法】收集急性髓系白血病患者骨髓5～10ml，F(xiàn)icoll分離提取單個核細胞，同時收集急性髓系細胞系（Raj

3、i、Dami、THP-1、SHI-1）細胞，提取基因組DNA,采用重硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法（COBRA）檢測DNA樣本甲基化程度；直接測序法檢測TWIST2基因啟動子區(qū)域13個 CpG位點的甲基化；免疫磁珠分選髓系白血病患者CD34+細胞，包括 AML30例，CML14例，正常對照6例，相對實時定量 PCR（Q-RT-PCR）檢測各組TWIST2表達量；構建TWIST2慢病毒載體，磷酸鈣沉淀法制備表達VENUS對照及TWIST2基因的慢病

4、毒，細胞生長曲線和集落生成實驗檢測VENUS和TWIST2對AML細胞株THP-1和Dami以及CML細胞株MEG-01和K562中的增殖能力影響；富集AML和CML患者CD34+細胞，過表達VENUS和TWIST2，檢測VENUS和TWIST2對原代造血干細胞的影響；在THP-1細胞中過表達VENUS和TWIST2，兩組裸鼠皮下注射一定量細胞，檢測細胞的成瘤能力，體內(nèi)實驗驗證基因的功能；為探討TWIST2抑制細胞增殖的機制，F(xiàn)ACS檢

5、測4個細胞系兩組細胞的周期進程，為進一步研究TWIST2基因作用的分子機制，采用點突變及PCR的方法構建TWIST2的4種突變體，包括TWIST2蛋白N端缺失（28個氨基酸）、C端缺失（20個氨基酸即Twist Box）、basic區(qū)域突變（74、75、76、78位的堿性氨基酸或酸性氨基酸突變?yōu)楸彼幔?、HLH區(qū)域突變（86位苯丙氨酸突變?yōu)楦彼幔?，磷酸鈣沉淀制備含突變體的慢病毒，并Western Blot（WB）檢測突變體的表達；K5

6、62細胞中檢測TWIST2及其突變體對細胞的增殖能力及集落生成能力的影響，F(xiàn)ACS檢測其對細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)其可能的重要功能結構域；富集4例CML患者CD34+細胞，在原代造血干細胞中檢測VENUS、TWIST2、TWIST2F86P對細胞集落生成的影響，進一步驗證HLH功能結構域的重要性；為研究TWIST2與伊馬替尼的相互作用，加入不同濃度IM，檢測K562細胞的集落生成數(shù)目；為進一步探討TWIST2作用的靶基因，首先Microar

7、ray分析比較THP-1/VENUS細胞和THP-1/TWIST2細胞的差異表達基因，進一步在K562及CMLCD34+細胞中用Q-RT-PCR驗證與白血病/腫瘤/造血發(fā)生相關的部分差異表達基因，CHIP方法檢測K562細胞中TWIST2直接作用的靶基因，克隆P21的啟動子區(qū)域，luciferase雙報告基因方法檢測靶基因P21的轉(zhuǎn)錄活性；
　　【研究結果】①收集20例急性髓系白血病患者骨髓單個核細胞及4個細胞系細胞， COBRA

8、檢測TWIST2甲基化程度，其中Raji、Dami、THP-1及部分患者甲基化程度較正常健康志愿者明顯增高，說明TWIST2在急性髓系白血病患者中甲基化程度及比例增高；異常高甲基化導致基因轉(zhuǎn)錄沉默，為此我們收集30例AML及14例CML患者CD34+細胞，Q-RT-PCR檢測到AML、CML患者TWIST2的表達與正常對照組比較降低，兩組分別與正常對照比較都有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；②構建過表達TWIST2的慢病毒載體，比較對照 V

9、ENUS及 TWIST2對髓系細胞（THP-1、Dami、K562、MEG-01）的增殖影響，結果顯示在4個細胞系中TWIST2都能抑制細胞生長，兩組比較均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）；對于單個細胞的集落生成實驗中也觀察到同樣的現(xiàn)象，TWIST2對原代造血干細胞的集落生成亦存在抑制作用，CML中VENUS組與TWIST2組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；③體外實驗我們已經(jīng)證實 TWIST2對細胞的抑制作用，進一步體內(nèi)實驗表明對照VE

10、NUS組裸鼠成瘤能力明顯高于TWIST2組，兩組（VENUS組與TWIST2組）比較存在統(tǒng)計學差異（P<0.01）；④體內(nèi)及體外實驗均證明TWIST2有抑制作用，進一步FACS檢測TWIST2對細胞周期的影響，結果顯示在4個細胞系中，TWIST2都能抑制細胞G1-S期轉(zhuǎn)換，在TWIST2組細胞被阻滯在G0/G1期，細胞分裂受阻，3次獨立重復試驗兩組（VENUS組與TWIST2組）比較存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）；⑤為進一步探討TWIS

11、T2作用的分子機制，構建TWIST2突變體，細胞增殖及集落生成實驗結果均提示 TWIST2抑制 K562細胞生長依賴bHLH區(qū)域，N-和C-并不是必需的區(qū)域；富集CMLCD34+細胞，VENUS、TWIST2、TWIST2F86P慢病毒轉(zhuǎn)染細胞，接種 CD34+細胞到含細胞因子的半固體甲基纖維素培養(yǎng)基，集落生成實驗結果提示TWIST2可以抑制CMLCD34+細胞的各種集落生成，而TWIST2F86P組集落數(shù)目明顯增多，VENUS組及TW

12、IST2F86P組分別與TWIST2組比較均存在統(tǒng)計學差異（P<0.05），進一步說明HLH區(qū)域是TWIST2抑制細胞生長的重要功能結構域；⑥FACS檢測TWIST2及其突變體對K562細胞周期的影響，結果表明TWIST2F86P及VENUS與TWIST2比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05），G0/G1期細胞阻滯消失；⑦IM處理轉(zhuǎn)染TWIST2及其突變體的K562細胞，結果顯示過表達TWIST2可以增強K562細胞對IM的敏感性；⑧為進一步

13、探討TWIST2的作用機制，Microarray分析到THP-1/VENUS和THP-1/TWIST2之間的差異表達基因共662個，Q-RT-PCR驗證與造血及腫瘤相關的基因15個，K562細胞和CMLCD34+細胞過表達TWIST2后Q-RT-PCR檢測相關差異表達的基因，P21及ID2的表達增高，TERT及CCND1的表達降低；CHIP檢測TWIST2的靶基因，結果顯示TWIST2組ID2、P21、CCND1基因的富集，是TWIST

14、2的靶基因；克隆細胞周期相關基因P21的啟動子，luciferase檢測發(fā)現(xiàn)TWIST2組P21的轉(zhuǎn)錄活性明顯比VENUS組和TWIST2F86P組高，P21是TWIST2的直接作用靶基因，TWIST2調(diào)控P21的轉(zhuǎn)錄活性。
　　【結論】
　　綜上所述，急性髓系白血病患者中TWIST2啟動子區(qū)域甲基化程度增高，而正常對照無甲基化。因為 TWIST2啟動子區(qū)域的高甲基化導致基因的表達沉默，故AML及 CML CD34+細胞中