脈沖電磁場對成骨細胞增殖、分化功能和Osterix基因表達的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察特定頻率和強度的脈沖電磁場(Pulsed Electromagnetic Field，PEMF)對新生SD大鼠顱骨來源成骨細胞增殖、分化功能和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix(OSX)基因(mRNA)表達的影響，探討PEMF對成骨細胞的直接作用，以期為臨床應(yīng)用PEMF治療骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)骨代謝性疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．成骨細胞分離、培養(yǎng)與鑒定：
　　 成骨細胞分離

2、與培養(yǎng)：
　　 取24h內(nèi)新生SD大鼠，雌雄不限。拉頸處死后，無菌條件下分離大鼠顱蓋骨，分別用胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復貼壁法獲取成骨細胞，于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。反復貼壁法進行人工傳代純化。本實驗所用成骨細胞均為第4代。
　　 成骨細胞鑒定：
　　 (1)倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征、生長狀況，并定時進行拍照。
　　 (2)堿性磷酸酶（Alkaline phosphata

3、se， ALP）染色法鑒定成骨細胞。
　　 2．觀察PEMF對成骨細胞增殖功能、分化功能和OSXmRNA表達的影響：
　　 取培養(yǎng)至第4代的成骨細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度，分別以4×104/ml的密度接種到96孔板、以4×104/ml的密度接種到24孔板和以1×105/ml的密度接種到25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，換入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h使細胞同步化，再換入新的正常培養(yǎng)基。將細胞分

4、為對照組和脈沖電磁場組(PEMF組)，對照組繼續(xù)正常培養(yǎng)，PEMF組采用頻率12Hz、強度11mT的PEMF進行干預(yù)，60min/(d·次)，共3d。干預(yù)結(jié)束后第2d進行如下指標檢測：
　　 (1)噻唑藍(MTT)法檢測成骨細胞增殖情況；
　　 (2)磷酸苯二鈉比色法檢測成骨細胞裂解液及細胞培養(yǎng)上清液中ALP活力的高低，觀察PEMF對成骨細胞分化能力的影響；
　　 (3)熒光定量RT-PCR方法檢測成骨細胞OSX

5、mRNA表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．成骨細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定：
　　 采用胰酶-膠原酶消化法和組織塊反復貼壁法所得成骨細胞的細胞形態(tài)特征和生長狀況均符合成骨細胞的特點。經(jīng)ALP染色后鑒定為成骨細胞。兩種方法所得細胞進行純化后均可得到純度較高的成骨細胞，用于實驗研究。
　　 2．PEMF對成骨細胞增殖功能、分化功能和OSXmRNA表達的影響：
　　 MTT結(jié)果顯示，與對照組（0.239±0

6、.116）相比，PEMF組細胞增殖(0.448±0.074)明顯增加，且差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01);ALP活力檢測結(jié)果表明，與對照組（2.552±0.493，0.745±0.372）相比，PEMF組成骨細胞裂解液（0.853±0.276）和細胞培養(yǎng)上清液中(0.620±0.175)ALP的活力值均明顯降低，而細胞裂解液的ALP活力降低更明顯（分別為P＜0.01，P＜0.05）；OSX基因表達結(jié)果顯示，與對照組(1.000±