載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽納米仿生骨基質(zhì)材料成骨能力和修復(fù)骨缺損的實驗研究.pdf

1、第一部分、BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料體外對大鼠BMSC粘附、增殖和誘導(dǎo)成骨分化的研究。 目的：構(gòu)建BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料，評價BMP-2活性肽對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC）的粘附、增殖及誘導(dǎo)成骨分化的影響。 方法：對聚乳酸－乙醇酸共聚物（PLGA）改性，制成PLGA-[ASP-PEG] 多元共聚物，同時用固相合成法合成寡肽BMP-2活性肽（P24）

2、，將其與PLGA-[ASP-PEG] 共價結(jié)合，構(gòu)建BMP-2活性肽（P24）/ PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)支架材料。實驗分三組，將大鼠BMSC與不同材料復(fù)合培養(yǎng)。A組為PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料，B組為PLGA-[ASP-PEG]材料，C組為單純的PLGA材料。流式細胞儀(FCM)對培養(yǎng)細胞性質(zhì)進行鑒定。沉淀法測定細胞與材料到粘附率。四甲基偶氮唑藍微量酶反應(yīng)比色法(MTT)、考馬斯亮藍法和掃描電鏡（SEM）

3、檢測BMSC體外增殖活性，成骨誘導(dǎo)標志物堿性磷酸酶（ALP）活性，骨鈣蛋白（OCN）含量，ALP染色和鈣結(jié)節(jié)染色了解BMSC成骨分化情況。 結(jié)果：FCM證實分離培養(yǎng)的細胞為BMSC。細胞粘附率檢測顯示，BMSC在P24/ PLGA-[ASP-PEG]材料表面和PLGA-[ASP-PEG]材料表面的粘附性能和增殖能力明顯高于PLGA表面，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與SEM、細胞生長曲線和細胞蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果一致。ALP活

4、性和OCN含量檢測顯示：P24誘導(dǎo)的A組ALP活性和OCN含量明顯高于B組和C組，ALP染色和鈣結(jié)節(jié)染色：P24誘導(dǎo)的A組出現(xiàn)陽性表現(xiàn)的時間最早。 結(jié)論：PLGA-[ASP-PEG]能促進BMSC在骨基質(zhì)材料表面的粘附、增殖并能較好地保持細胞的形態(tài)，PLGA-[ASP-PEG]材料及其降解產(chǎn)物不影響B(tài)MSC的成骨分化，P24能體外誘導(dǎo)BMSC向成骨方向分化，具有與BMP-2類似的骨誘導(dǎo)活性。 第二部分、BMP-2活性肽體

5、外定向誘導(dǎo)大鼠BMSC向成骨方向分化的劑量依賴性研究。 目的：探討自行合成的寡肽P24對大鼠BMSC體外定向誘導(dǎo)成骨分化的能力，評價P24的成骨誘導(dǎo)活性及體外誘導(dǎo)成骨的最佳劑量。 方法：取4周齡SD大鼠分離培養(yǎng)BMSC，傳至第3代時改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入濃度為300、200、100、50和0μg/ml的P24，并依次記為A、B、C、D和E組。觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，檢測細胞的ALP活性和OCN含量，實時熒光定

6、量RT-PCR檢測成骨標志物基因Ⅰ膠原（COL-Ⅰ）、骨橋蛋白（OPN）及OCN mRNA的表達。 結(jié)果：倒置相差顯微鏡下觀察，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4d，培養(yǎng)細胞形態(tài)由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?。隨著培養(yǎng)基中P24濃度的增加，細胞發(fā)生成骨樣改變的時間提前。ALP活性和OCN含量檢測顯示，A和B組ALP活性和OCN含量較其他三組增加明顯，差異有顯著性（P<0.05），組間比較，差異無顯著性（P>0.05）。實時熒光定量RT-P

7、CR檢測顯示培養(yǎng)14d，成骨誘導(dǎo)標志物COL-Ⅰ、OPN和OCN mRNA在各組均有表達。A組和B組的Ct值明顯大于C組和D組，差異有顯著性（P<0.05），但A組和B組之間差異無顯著性（P>0.05）。 結(jié)論：P24體外能有效地誘導(dǎo)BMSC向成骨方向分化，在PLGA-[ASP-PEG]材料體系中，最適合的P24體外誘導(dǎo)劑量認為是200μg/ml。 第三部分、BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料異

8、位成骨的實驗研究。 目的：評價P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料的異位成骨能力。 方法：成年雄性SD大鼠48只，隨機分成三組，分別在大鼠背部雙側(cè)豎脊肌淺層肌袋中植入不同材料。A組：P24/ PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料；B組：單純PLGA-[ASP-PEG]材料；C組：單純的明膠海綿材料。X線、CT+三維成像觀察植入物成骨情況，不同時間點病理切片，行組織學(xué)觀察，western blot檢測植

9、入?yún)^(qū)成骨標志物Col-I及OPN蛋白的表達，實時熒光定量RT-PCR檢測Col-I及OPN mRNA的表達。 結(jié)果：X線、CT+三維成像：8周時，A組可見明顯的成骨表現(xiàn)，B組偶見成骨樣影像，C組未見新骨表現(xiàn)。組織學(xué)觀察：A組8周骨小梁明顯增粗增寬，表面形成類骨密質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可見大量新骨形成，在新骨外周部有骨小梁及新生血管。B組8周時植入?yún)^(qū)纖維組織增生，偶見軟骨細胞及少量成骨細胞。C組8周明膠海綿吸收，呈現(xiàn)肌肉組織表現(xiàn)，未見新骨形成

10、。實時熒光定量RT-PCR：各組8周均有Col-I mRNA和OPN mRNA的表達，A組中Col-I mRNA和OPN mRNA為高表達。與western blot檢測結(jié)果一致。 結(jié)論：構(gòu)建的P24/PLGA-[ASP-PEG] 仿生骨基質(zhì)材料能夠誘導(dǎo)異位成骨，P24具有與天然BMP-2類似的異位誘導(dǎo)成骨能力和骨誘導(dǎo)活性，其成骨過程以軟骨內(nèi)化骨為主。 第四部分、BMP-2活性肽/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材

11、料修復(fù)兔股骨缺損的實驗研究。 目的：探討P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料修復(fù)兔股骨中段臨界大小骨缺損的可行性。 方法：36只新西蘭大白兔制備成股骨中段15mm的臨界大小骨缺損模型。按實驗設(shè)計分為三組。A組：植入P24/PLGA-[ASP-PEG] 仿生骨基質(zhì)材料，B組植入PLGA-[ASP-PEG]材料；C組，植入單純的明膠海綿。5孔鋼板螺釘內(nèi)固定。X 線觀察，組織學(xué)觀察、修復(fù)組織ALP測定以及生物力學(xué)

12、測試，比較各組材料修復(fù)骨缺損的能力。 結(jié)果：X線顯示及評價：A組8周骨痂與宿主骨界限模糊，骨痂密度不均勻，皮質(zhì)骨輪廓出現(xiàn)，骨缺損已基本消失，有典型的骨愈合影像；12周骨痂開始塑性，新生骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，與斷端骨自然連接，髓腔有再通趨勢。按照X線骨缺損愈合分級，16周時4級以上為9只（優(yōu)良率64.28％）。B組12周缺損區(qū)有少量骨痂生成，斷端吸收變細，髓腔開始閉鎖，缺損區(qū)依然存在。X線骨缺損愈合分級0級為5只（占62.5％）。C組：

13、12周骨缺損區(qū)表現(xiàn)為骨不連影像，髓腔閉鎖，鋼板有松動跡象。X線骨缺損愈合分級均為0級。組織學(xué)觀察：A組：8周時成骨細胞活躍，新骨大量增生，相互融合生長，呈編織骨和骨小梁結(jié)構(gòu)，骨小梁鈣化形成板層股。12周時編織骨增厚密集，呈典型的板層骨結(jié)構(gòu)，骨細胞趨于成熟，有血管形成和長入，不規(guī)則骨髓腔出現(xiàn)。B組：8周纖維組織增生，材料部分吸收。12周植入?yún)^(qū)兩端與宿主骨交界處，新骨增生，可見骨小梁和板層骨。植入?yún)^(qū)中央材料大部分吸收，可見大量的纖維組織，偶

14、見軟骨細胞。C組：12周缺損區(qū)被纖維結(jié)締組織填充，骨端增生不活躍，髓腔封閉。生物力學(xué)測試：A組最大抗彎曲負荷122.14±12.83N，與同組正常骨參照值相比，修復(fù)比率為87.42％。B組最大抗彎曲負荷38.38±8.09N，與同組正常骨參照值相比，修復(fù)比率為26.89％。二者具有統(tǒng)計學(xué)差異性（P＜0.05）。 結(jié)論：體外構(gòu)建的P24/PLGA-[ASP-PEG]仿生骨基質(zhì)材料是一種理想的組織工程支架材料，能誘導(dǎo)啟動典型的軟骨內(nèi)