蜂膠奧硝唑聯(lián)合對(duì)牙齦卟啉單胞菌和人牙齦成纖維細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 牙周炎是牙周組織炎癥性疾??；菌斑細(xì)菌及其產(chǎn)物是牙周炎最主要的病因，是引發(fā)牙周炎必不可少的始動(dòng)因子。成纖維細(xì)胞是牙周組織中最多、功能上最重要的細(xì)胞，任何原因所造成的成纖維細(xì)胞的破壞，均能影響牙支持組織的健康。故一種理想的牙周炎治療藥物，既要達(dá)到良好的抑菌效果，又要保護(hù)牙周組織，具有較小的毒性作用。 目前第3代硝基咪唑類(lèi)衍生物奧硝唑因其具有較強(qiáng)的抗厭氧菌活性，成為治療牙周炎的主要抗菌藥物，而抗生素的長(zhǎng)期用藥具有逐漸產(chǎn)

2、生耐藥性的潛在隱患。牙周炎作為一種多細(xì)菌混合感染、局部全身因素共同影響的疾病，一種抗厭氧菌的單一藥物無(wú)法達(dá)到良好的治療效果，現(xiàn)在普遍推崇聯(lián)合用藥方案。尋求一種可行且有效的聯(lián)合用藥方案成為牙周炎治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 近年來(lái)，蜂膠因其具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理作用得到人們的關(guān)注。以往研究已證實(shí)蜂膠和部分抗生素具有抑菌協(xié)同作用，然而主要集中在蜂膠與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物、多肽類(lèi)抗生素、氨基苷類(lèi)抗生素、四環(huán)素和氯霉素類(lèi)抗生素的聯(lián)合用藥研究，且對(duì)

3、需氧菌，如金黃色葡萄球菌的抑菌活性研究較多。在牙周炎治療領(lǐng)域，將蜂膠與牙周抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，研究其對(duì)牙周厭氧菌的抗菌活性，目前未見(jiàn)報(bào)道。考慮蜂膠廣泛的藥物學(xué)作用及協(xié)同抑菌的特點(diǎn)，將蜂膠與抗生素聯(lián)合應(yīng)用治療牙周炎，有望成為一種新型配伍方案。 目的： 本研究在參考國(guó)內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，將國(guó)產(chǎn)水溶性蜂膠和奧硝唑聯(lián)合，研究其對(duì)牙齦卟啉單胞菌(Pg)的體外生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞(HGF)的毒性作用，初步探索蜂膠與奧硝唑聯(lián)合

4、治療牙周炎的可行性，為其更加深入地研究提供初步依據(jù)。 材料與方法： 1.蜂膠抑制Pg體外生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究。用心腦浸液(BHI)+Hemin培養(yǎng)基按2倍稀釋法將蜂膠和奧硝唑分別稀釋成8個(gè)濃度和14個(gè)濃度的藥液。每個(gè)試管加入0.5ml標(biāo)化的菌液(106～107CFU/mL)，充分混勻后，厭氧培養(yǎng)48 h。觀察試管的混濁情況，選擇適當(dāng)濃度段劃線(xiàn)接種于BHⅡ血瓊脂平板上。經(jīng)厭氧培養(yǎng)48 h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(

5、MBC)，設(shè)立陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。 2.蜂膠奧硝唑聯(lián)合抑制Pg體外生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究。采用紙片擴(kuò)散法，將奧硝唑(0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 g/L五個(gè)濃度)和蜂膠(100、50、25g/L三個(gè)濃度)單獨(dú)藥敏片及各濃度結(jié)合后的合劑藥敏片貼在接種了Pg的BHI血瓊脂培養(yǎng)基平皿內(nèi)。37℃厭氧培養(yǎng)48 h，測(cè)定每一藥敏片的抑菌環(huán)直徑。每種藥敏片重復(fù)4次。 3.蜂膠奧硝唑聯(lián)合對(duì)HGF的細(xì)胞毒性研究。消化第

6、5代細(xì)胞，接種于96孔板，設(shè)陰性對(duì)照組，在37℃，95％濕度和5％CO2的條件下培養(yǎng)24 h，再用含有各濃度蜂膠、蜂膠奧硝唑合劑或奧硝唑的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用MTT比色法測(cè)定吸光度值(A值)。計(jì)算出細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)。每種試劑選擇RGR約為50％的濃度組進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的研究。消化第6代細(xì)胞，接種于96孔板，每15孔為一組，一共8組，培養(yǎng)24 h。換上含有試劑的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，選擇第1組用MTT比色法測(cè)定A值。其余7組

7、棄去含有試劑的培養(yǎng)液，換上新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)7d，每天選擇1組進(jìn)行A值測(cè)定。最后繪制各生長(zhǎng)曲線(xiàn)，與陰性對(duì)照組曲線(xiàn)比較。 結(jié)果： 1.蜂膠水溶液對(duì)Pg具有較好的生長(zhǎng)抑制作用，當(dāng)濃度為1.56g/L時(shí)，就無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，其作用與0.125～0.25mg/L的奧硝唑相當(dāng)。 2.100 g/L蜂膠的平均抑菌環(huán)大小僅為10.25mm；蜂膠與奧硝唑聯(lián)合后，含100 g/L蜂膠的合劑1組的抑菌環(huán)大小均大于對(duì)應(yīng)濃度的單獨(dú)奧硝唑

8、組，含50 g/L蜂膠的合劑2組和含25 g/L蜂膠的合劑3組在奧硝唑低濃度時(shí)的抑菌環(huán)大小也大于對(duì)應(yīng)濃度的單獨(dú)奧硝唑組。隨著蜂膠濃度的增加，抑菌環(huán)增大。析因分析結(jié)果表明，蜂膠與奧硝唑?qū)g的生長(zhǎng)抑制作用存在協(xié)同作用。 3.隨著藥物濃度的降低，HGF的RGR趨于100％，毒性級(jí)別趨于O。奧硝唑濃度為0.4g/L或0.8/L時(shí)，合劑組的A值均高于對(duì)應(yīng)濃度的奧硝唑組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；奧硝唑濃度為0.2g/L或1.2g

9、/L時(shí)，三組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.1.2g/L奧硝唑組、1.2g/L奧硝唑和1g/L蜂膠合劑組、1.2g/L奧硝唑和0.5g/L蜂膠合劑組及48/L蜂膠組的RGR均約為50％。換上不含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)7 d測(cè)定每組A值，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.05)；各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＜0.05)，但隨著時(shí)間推移，各實(shí)驗(yàn)組的A值均逐漸趨向于陰性對(duì)照組。

10、 結(jié)論： 1.蜂膠對(duì)Pg具有良好的生長(zhǎng)抑制作用，MBC為1.56 g/L。 2.蜂膠奧硝唑聯(lián)合對(duì)Pg的生長(zhǎng)抑制作用優(yōu)于奧硝唑及蜂膠的單獨(dú)用藥，表明蜂膠與奧硝唑?qū)g的生長(zhǎng)抑制作用具有協(xié)同作用。 3.1g/L和0.5g/L低濃度蜂膠不會(huì)增加奧硝唑?qū)GF的細(xì)胞毒性作用，甚至在奧硝唑部分濃度段，表現(xiàn)出降低奧硝唑細(xì)胞毒性作用的效果。 4.HGF分別在含有1.2g/L奧硝唑、1.2g/L奧硝唑和1g/L蜂膠合劑、