氨上調(diào)星形膠質(zhì)細胞TRPC1基因的表達.pdf

1、尿素循環(huán)缺陷、雷爾氏綜合征或肝功能衰竭引起的高氨血癥可以導(dǎo)致多種精神和行為異常，如神志不清、健忘、煩躁和意識改變包括昏睡、嗜睡，晚期可以由腦水腫導(dǎo)致昏迷甚至是死亡。氨在肝性腦病中的致病作用在20世紀30年代就已經(jīng)被確定，現(xiàn)在人們普遍接受特征性癥狀學(xué)由腦內(nèi)氨濃度升高到3～5mM所致。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，氨慢性處理能增強培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細胞Na+，K+-ATP酶(NKA)的活性。主要與Na，K+-ATP酶α2亞基表達增加相關(guān)，氨依賴性的內(nèi)

2、源性哇巴因復(fù)合物生成增加，哇巴因與NKA結(jié)合，激活后續(xù)的Src，EGF受體，Raf, Ras，MEK和ERK1/2信號通路。ERK1/2的磷酸化誘導(dǎo)α基因表達上調(diào)。而且，這個信號通路結(jié)果與腎細胞系中低濃度哇巴因誘導(dǎo)的信號通路幾乎相同。
　　星形膠質(zhì)細胞與其他非興奮性神經(jīng)細胞在形態(tài)和功能上高度不同，它們利用細胞內(nèi)Ca2+和Na+濃度的動態(tài)波動完成它們的興奮性。通過細胞內(nèi)Ca2+釋放的Ca2+通道，如InsP3受體（InsP3Rs）和

3、蘭尼堿受體(RyRs)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER) Ca2+的釋放被認為是膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca+信號的主要機制。ER內(nèi)Ca2+持續(xù)釋放，導(dǎo)致ER內(nèi)Ca+耗竭，可以激活Ca2+池操縱性細胞膜Ca2+內(nèi)流(store-operated plasmalemmal Ca2+entry，SOCE)，也被稱為容量性Ca+內(nèi)流(capacitative Ca2+ entry)。同時期的研究觀點表明，SOCE可通過ORAI通道誘導(dǎo)鈣釋放激活的鈣電流(ICRAC)或者通

4、過細胞膜瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)陽離子通道來介導(dǎo)。星形膠質(zhì)細胞SOCE主要和基本的組分由“經(jīng)典”的TRP通道（“canonical”TRP channels）代表;其中TRPC1，4和5在星形膠質(zhì)細胞表達。TRPC1亞基是通道的主要組分，因此負責通道的主要功能，而TRPC4/5是輔助亞基。用反義寡核苷酸敲除TRPC1或應(yīng)用TRPC1阻斷性抗體大大的降低星形膠質(zhì)細胞SOCE。

5、　　已經(jīng)報道用5mM氨急性處理由于氨誘導(dǎo)細胞內(nèi)堿化增加ER內(nèi)Ca2+釋放。然而，臨床上很多藥物慢性作用均能影響星形膠質(zhì)細胞InsP3Rs誘導(dǎo)的ER內(nèi)Ca+釋放。最近，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由InsP3Rs和RyRs活化介導(dǎo)的ER內(nèi)Ca2+釋放和容量性Ca2+攝取，可以被選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀、抗雙極抑郁藥鋰、卡馬西平和丙戊酸抑制。已經(jīng)證實，三種抗雙極抑郁藥均下調(diào)TRPC1基因的表達。
　　星形膠質(zhì)細胞表達多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，包括

6、β1-腎上腺素能受體、Gs-偶聯(lián)受體和α2-腎上腺素能受體、Gi/o型偶聯(lián)受體。在星形膠質(zhì)細胞激活這兩種受體導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+濃度增加和表皮生長因子受體(EGFR)轉(zhuǎn)激活。激活β1受體可以誘導(dǎo)PKA依賴性Gs/Gi轉(zhuǎn)換，從而，導(dǎo)致細胞內(nèi)儲存Ca2+釋放。然而，α2A腎上腺素能受體有效和特異性激動劑右旋美托咪啶，可以導(dǎo)致βγ亞基從Giα解離，而后者可以激活磷脂酶C。
　　星形膠質(zhì)細胞是肝性腦病主要的細胞基礎(chǔ)，星形膠質(zhì)細胞特異性的谷氨

7、酰胺合成酶是中樞氨解毒作用的主要酶。腦氨水平增高的腦谷氨酰胺合成酶的活性增強可以影響星形膠質(zhì)細胞主要的自身穩(wěn)態(tài)功能，包括可以導(dǎo)致異常神經(jīng)傳遞和腦水腫的K+、谷氨酸和水平衡;肝性腦病的基礎(chǔ)可以認為是膠質(zhì)細胞的病理毒理損害。本研究中，我們主要研究病理濃度的氨對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)鈣信號的影響。
　　在本研究中，我們主要研究:①氨慢性處理對異丙腎上腺素和右旋美托咪啶誘導(dǎo)的Ca2+釋放的影響;②氨慢性處理對InsP3Rs和RyRs誘導(dǎo)的Ca2+

8、釋放的影響;③氨慢性處理對SOCE的影響;④氨慢性處理對TRPC1 mRNA和蛋白表達的影響;⑤哇巴因抑制劑坎利酮對原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞氨誘導(dǎo)的TRPC1基因表達和SOCE的抑制作用;⑥注射尿素酶3天后的CD-1小鼠腦組織TRPC1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達;⑦注射尿素酶3天后特殊熒光標記的轉(zhuǎn)基因小鼠新鮮分離的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞TRPC1 mRNA的表達。
　　方法:
　　氯化銨慢性作用細胞3天，進行如下實驗:①細胞用

9、熒光探針染料Fura-2負載，奧林巴斯活細胞熒光顯微鏡下檢測氯化銨慢性作用對β-腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素和α2-腎上腺素受體激動劑右旋美托咪啶刺激引起細胞內(nèi)Ca2+增加的影響;②利用熒光探針技術(shù)，檢測氯化銨慢性作用對RyRs激動劑4-CMC和InsP3Rs激動劑AdA刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞Ca2+增加的影響;③利用熒光探針技術(shù)，檢測哇巴因抑制劑坎利酮對氯化銨慢性處理引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞Ca+內(nèi)流增加的影響;④用RT-PC

10、R和免疫印跡方法檢測哇巴因抑制劑坎利酮對氯化銨慢性處理原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達的影響;⑤CD-1小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，用RT-PCR和免疫印跡方法檢測尿素酶對腦組織TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達的影響;⑥FVB/NTg(GFAP-GFP)14Mes/J或者B6.Cg-Tg(Thy1-YFPH)2Jrs/J轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射尿素酶3天建立高血氨模型后，取腦組織制備新鮮細胞懸液

11、采用流式細胞儀分離星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞，用RT-PCR檢測尿素酶對星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞TRPC1 mRNA和TRPC1蛋白表達的影響;使用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組資料用one-wayANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　1、氯化銨慢性處理能夠增強異丙腎上腺素和右旋美托咪啶刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度
　　β-腎上腺素受體激動劑異

12、丙腎上腺素或者α-腎上腺素受體激動劑右旋美托咪啶刺激后能迅速引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，氯化銨作用3天后的星形膠質(zhì)細胞給予刺激后，細胞內(nèi)Ca2+濃度增加幅度變大，且很快恢復(fù)正常，氯化銨能明顯增加異丙腎上腺素或右旋美托咪啶刺激引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度。
　　2、氯化銨慢性處理能夠增強4-CMC、AdA刺激引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度
　　RyRs的激動劑4-CMC或InsP3Rs的激動劑AdA刺

13、激細胞后能夠引起細胞內(nèi)濃度的增加，氯化銨作用3天后能明顯增加4-CMC或AdA刺激引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度增加的幅度，4-CMC作用緩慢而持久，AdA作用迅速而短暫，刺激后細胞內(nèi)Ca2+濃度迅速增加。
　　3、哇巴因抑制劑坎利酮對氯化銨慢性處理引起原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞Ca2+內(nèi)流增加的影響
　　Thapsigargin是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATP酶的抑制劑，將細胞加入Thapsigargin作用10 min，耗竭星形膠質(zhì)細

14、胞內(nèi)儲存的Ca2+，再重新加入CaCl2。細胞加入Thapsigargin刺激后，細胞內(nèi)Ca2+濃度短暫增加，氯化銨對此作用沒有影響。與正常對照組細胞相比，當加入CaCl2后，氯化銨慢性作用組星形膠質(zhì)細胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流幅度增加25％，哇巴因抑制劑坎利酮能夠明顯抑制氯化銨慢性作用引起的細胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流的增加，使細胞內(nèi)容量性Ca2+內(nèi)流的增加幅度恢復(fù)到正常水平。
　　4、氯化銨慢性作用上調(diào)原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞TRPC1m

15、RNA及TRPC1蛋白的表達，這一作用可以被哇巴因抑制劑坎利酮所抑制
　　慢性氨作用引起的鈣池操控性鈣離子內(nèi)流峰值的增加與氯化銨慢性處理3天引起特異性TRPC1蛋白和mRNA表達升高有關(guān)。原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞應(yīng)用氯化銨作用3天后濃度依賴性使TRPC1 mRNA及蛋白表達上調(diào)，而哇巴因抑制劑坎利酮能夠明顯抑制氯化銨慢性作用引起的TRPC1 mRNA及蛋白表達的上調(diào)。
　　5、尿素酶慢性作用上調(diào)CD-1小鼠腦組織TRPC1 mR

16、NA及TRPC1蛋白的表達
　　腹腔注射尿素酶(33 units/kg/day)或者生理鹽水作為對照組，尿素酶對在體腦組織TRPC1 mRNA及TRPC1蛋白表達的影響與氯化銨慢性處理原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的作用相似，尿素酶作用3天能夠上調(diào)腦組織TRPC1mRNA及TRPC1蛋白的表達。
　　6、尿素酶慢性作用上調(diào)在體星形膠質(zhì)細胞TRPC1 mRNA表達，但是對神經(jīng)元細胞TRPC1 mRNA表達無影響
　　腹腔注射尿素

17、酶(33 units/kg/day)作用3天后，取腦組織制作懸液通過FACS分選獲得新鮮星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞。尿素酶能夠上調(diào)新鮮星形膠質(zhì)細胞TRPC1 mRNA表達，在神經(jīng)元細胞尿素酶沒有作用。
　　討論
　　星形膠質(zhì)細胞谷氨酰胺合成酶的中樞作用和肝性腦病時星形膠質(zhì)細胞相關(guān)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)障礙已經(jīng)獲得了公認。而高氨血癥時星形膠質(zhì)細胞信號的病理性重塑機制仍未完全明了。本研究從體內(nèi)及體外實驗對高血氨模型的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+信號改

18、變進行系統(tǒng)研究。我們特別研究了病理濃度的氨慢性處理對:①促代謝性受體誘導(dǎo)Ca2+釋放的影響;②InsP3R和RyR激動劑誘導(dǎo)Ca2+釋放的影響;③SOCE的影響;④體外實驗TRPC1基因和蛋白表達的影響;⑤在體高血氨動物模型TRPC1基因和蛋白表達的影響。
　　首先，我們發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞氨慢性處理（體外高血氨毒性模型）能夠增強代謝性受體激活誘導(dǎo)的Ca2+信號。這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放是星形膠質(zhì)細胞Ca2

19、+信號的主要來源）增加的直接結(jié)果，因為氨慢性處理也能夠增強直接刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放通道InsP3Rs和RyRs引起的Ca2+增加。這種鈣離子增加的機制可能是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+容量的增加，容量的增加可以增加Ca2+離子的電驅(qū)動性和使釋放通道更容易開放，也可能是由于鈣離子釋放通道密度的增加，或者兩者均有之。相關(guān)的機制仍需進一步進行研究。促代謝性受體激活誘發(fā)的Ca2+信號增加可以促進肝性腦病的病理進展，如可以增加囊泡谷氨酸的釋放（氨急性作

20、用促進星形膠質(zhì)細胞谷氨酸的釋放已經(jīng)被證實）。
　　其次，我們發(fā)現(xiàn)氨慢性作用能夠顯著增強星形膠質(zhì)細胞SOCE。SOCE的增加主要反映TRPC1通道的表達增加，我們已經(jīng)在體外細胞實驗觀察到了TRPC1基因和蛋白表達的增加。同樣的結(jié)果我們也在注射尿素酶致氨損傷的小鼠腦組織發(fā)現(xiàn)。此外，TRPC1只在星形膠質(zhì)細胞有增加，我們通過腹腔注射尿素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠分選出的新鮮細胞進行了實驗。尿素酶的慢性作用只上調(diào)星形膠質(zhì)細胞的TRPC1表達，而不影響

21、神經(jīng)元的TRPC1表達。
　　星形膠質(zhì)細胞SOCE主要由TRPC1，4，5通道介導(dǎo)，而在小膠質(zhì)細胞則認為是STIM/ORAI復(fù)合物在起主要作用。我們實驗室之前的研究證實特異性siRNA抑制TRPC1的表達、氟西汀慢性作用或抗雙極抑郁藥能夠抑制原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞的SOCE和激動劑誘導(dǎo)的Ca2+。TRPC1通道由于它們的滲透性在星形膠質(zhì)細胞控制著幾種溶質(zhì)離子的信號，在生理條件下TRPC1允許Ca2+和Na+內(nèi)流。Na+內(nèi)流可以產(chǎn)生溶

22、質(zhì)Na+信號，這個信號可以控制和調(diào)整負責膠質(zhì)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能的很多分子，例如包括:K+緩沖，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元的代謝支持，這些對氨誘導(dǎo)的肝性腦病具有重要作用。TRPC1表達的上調(diào)和SOCE的增加可以被哇巴因抑制劑坎利酮完全抑制，我們之前的實驗也證實了坎利酮能夠抑制氨誘導(dǎo)的膠質(zhì)細胞水腫?？怖淖饔糜赏郯鸵?Na, K-ATPase/Src/EGFR/PI3K-AKT/ERK1/2信號通路介導(dǎo)，這條信號通路似乎與氨依賴的細胞病理學(xué)有關(guān)。

23、這條通路能夠調(diào)整影響肝性腦病的幾種基因的表達，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1，水通道蛋白4和GFAP，成為肝性腦病治療干預(yù)的重要靶點。另一個相關(guān)性的治療策略與抗抑郁有關(guān)，如選擇性5羥色胺再吸收抑制劑氟西汀、抗精神病藥鋰、卡馬西平和丙戊酸均已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能夠減少星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca+庫來源的Ca2+信號，而且下調(diào)TRPC1的表達。
　　結(jié)論:
　　病理濃度的氨可以增強異丙腎上腺素、右旋美托咪啶、AdA、4-CMC刺激引起的星形膠質(zhì)