體內外研究羥基膽固醇硫酸基轉移酶(SULT2B1b)及其硫化產物對肝臟增生的影響及機制.pdf

1、前言
　　 胞漿硫酸基轉移酶(SULT)2B1b能夠催化膽固醇及羥基膽固醇的3β-羥基硫酸化，其催化25-羥化膽固醇(25HC)硫酸化反應的主要產物為3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)。研究發(fā)現SULT281b能夠抑制羥基膽固醇對肝X受體(LXRs)的激活，并且其硫酸化產物可以通過抑制LXR/SREPs信號轉導通路降低細胞內脂質水平。而LxRs信號途徑的激活對細胞增殖起負調節(jié)作用。因此SULT2B1b及其硫化產物25HC

2、3S可能對肝臟增生起重要作用。本實驗中，我們在小鼠正常肝臟、原代大鼠肝臟細胞(PRH)以及小鼠肝臟部分切除術(PH)模型中研究SULT281b對肝臟增生的作用及機制，并在小鼠正常肝臟中檢測SULT281b的硫化產物25HC3S對肝臟增生的影響及相關機制。
　　 第一部分體內外研究SULT2B1b對肝臟增生的影響
　　 第一節(jié) SULT2B1b對小鼠肝臟增生以及原代大鼠肝細胞(PRH)生長的影響及相關機制
　　 目

3、的：探索SULT2B1b對小鼠肝臟以及PRH增生的影響及機制。
　　 方法：將含有SULT2B1b基因的腺病毒感染C57BL/6小鼠及PRH后，運用PCNA免疫組織化學染色法檢測肝臟增生狀態(tài)；應用免疫熒光雙染法定位肝臟內SULT281b與PCNA的表達；采用siRNA干擾技術反面驗證SULT281b對肝細胞生長的影響；通過實時定量PCR和免疫印跡的方法檢測基因表達水平。
　　 結果：體內實驗表明小鼠肝臟組織中的PCNA陽

4、性細胞率隨SULT281b表達水平的升高而明顯增加，并存在劑量和時間依賴性；肝臟內幾乎所有存在PCNA表達的細胞核均伴隨SULT2B1b在細胞質的高表達，而沒有SULT2B1b表達的細胞內也檢測不到PCNA的表達。在SULT281b相對高表達的PRH內，采用RNA干擾技術抑制SULT281b基因的表達，引起細胞周期調節(jié)基因CDK2，FoxM1b，與Cyclin A的表達明顯降低。此外，LXR人工合成激動劑T0901317可有效阻斷體內外

5、SULT281b所誘導的PCNA表達升高。
　　 結論：SULT281b能夠通過抑制LXR信號轉導通路的活性促進體內外肝細胞增生。
　　 第二節(jié)在部分肝切除術(PH)后的小鼠模型中研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機制
　　 目的：研究SULT2B1b對肝臟再生的影響及機制。
　　 方法：在C57BL/6小鼠體內建立肝臟PH再生模型，并通過尾靜脈注射含有SULT2B1b基因的腺病毒或對照病毒；病毒感染

6、5天后，應用免疫組織化學的方法分析肝再生過程中的PCNA陽性細胞率；采用HPLC技術檢測肝臟內羥基膽固醇的變化；運用實時定量PCR和免疫印跡法檢測基因表達水平。
　　 結果：SULT281b過表達的小鼠肝臟恢復較快，約于術后三天恢復到肝臟原始大小的80％，而對照組需要將近5天達到同樣水平。SULT281b過表達增加了肝臟再生過程中的PCNA陽性細胞率以及增生相關基因的表達水平；降低了肝臟內的羥基膽固醇含量以及LXR信號轉導通路下

7、游基因SREBP-1和ABCA1的表達水平。
　　 結論：SULT281b能夠通過抑制羥基膽固醇/LXR信號轉導通路促進肝臟損傷后的再生。
　　 第二部分在小鼠體內研究羥基膽固醇硫化物對肝臟增生的影響及其相關機制
　　 目的：探索SULT281b的硫化產物(25HC3S)對小鼠體內肝臟增生的影響及機制
　　 方法：向C57BL/6小鼠尾靜脈直接注射3-硫酸-25-羥化膽固醇(25HC3S)化合物，或向感染

8、了腺病毒(Ad-SULT281b)兩天后的C57BL/6小鼠腹腔內注射25HC，建立高濃度外源性或內源性25HC3S的小鼠模型；應用[3H]標記25HC3S并經尾靜脈注射小鼠體內，追蹤25HC3S在各組織器官中的分布及其藥代動力學；采用實時定量PCR，細胞周期PCR芯片以及免疫印跡法檢測相關基因的表達水平。以PCNA為增生標記，應用免疫組織化學技術分析肝臟中PCNA的陽性細胞數。
　　 結果：外源性25HC3S給藥后在小鼠體內廣

9、泛分布于各組織器官，并在注射后48小時左右減至初始劑量的一半；25HC3S的增加上調了肝臟內增牛相關基因Wt1，Pcna，cMyc，cyclin A，FoxM1b，CDC25b的表達，卻下調了細胞周期停滯基因Check2以及凋亡誘導基因Apaf1的表達；無論外源性給藥還是內源性合成，25HC3S的應用均有效增加了PCNA陽性細胞率，降低了LXR信號轉導通路下游基因如ABCA1和SREBP-1c的表達；最后，LXR的人工合成激動劑T090