Cavl不同表達對U87膠質瘤細胞的影響以及細胞外ATP對U87膠質瘤侵襲和遷移研究.pdf

1、一、研究背景及目的：
　　 膠質瘤(glioma)是人顱內最常見的腫瘤，其生物學特性中最重要的特點是腫瘤細胞侵入到正常腦組織，圍繞在原發(fā)灶周圍形成所謂的“衛(wèi)星腫瘤灶”，而且常要侵襲腦的重要功能區(qū)，由于沒有合理的切實可行的辨認腫瘤邊界的方法或者技術，因此一直以來手術切除腫瘤的程度很有限，而且術后腫瘤復發(fā)的幾率隨著病理級別的升高而升高，更為可怕的是人腦膠質瘤中的大約50%左右是膠質母細胞瘤(glioblastoma)，它們的特性是侵

2、襲性強、復發(fā)時間短、預后差?，F代計算機斷層掃描、術前MRI(核磁共振)等影像技術仍難以準確的確定腫瘤邊界，即使術中使用了普通顯微鏡，但是放大倍數還很有限，仍然難以辨認腫瘤界限，而且殘留的腫瘤細胞即使僅占1mm3體積細胞數目將達到109個，因此，研究膠質瘤侵襲性生長的機制對于臨床治療膠質瘤患者有著重要的意義。
　　 Caveolin-1(Cav1)是細胞膜脂質微區(qū)上的一種膜蛋白，又稱小窩蛋白，主要作用就是保持膜脂質微區(qū)結構和功能的

3、完整，在人體信號轉導、細胞內吞、膜脂調節(jié)、脂肪轉運及膽固醇代謝平衡等方面具有重要作用。近年來，Cav1在各種腫瘤的影響越來越被重視，但是它是促進還是抑制腫瘤生長仍存在很多矛盾。我們課題組前期免疫組化檢測也發(fā)現Ⅳ級膠質瘤中Cav1高表達，而且發(fā)現膠質瘤中Cav1 mRNA水平與膠質瘤級別和Ki67陽性細胞數量呈正相關。
　　 ATP作為人體重要的能量與代謝物質，在中樞神經系統(tǒng)，ATP及其受體構成的信號通路還參與了膠質細胞細胞的增生

4、、遷移、分化及神經元之間的相互作用過程。近來研究發(fā)現膠質瘤細胞對細胞外ATP的降解速度遠低于膠質細胞(9)，膠質瘤細胞在生長過程中對膠質細胞的毒性作用和破壞也可導致ATP釋放，因此膠質瘤細胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；而ATP可通過激活其P2Y2受體活化G12和G0，從而促進RhoA-Rock-MLC磷酸化，誘導應力纖維形成和細胞的侵襲，但是這個過程需要P2Y2受體與αv整合素結合，若阻斷P2Y2受體與αv整合素的結合可完全抑制膠質

5、瘤細胞的侵襲，但影響P2Y2受體與αv整合素結合的因素并不清楚。前期的研究已經明確，整合素與多種G蛋白耦聯受體在細胞膜上主要分布于富含Cav1的脂質微區(qū)中，與Cav1相互結合形成復合體參與多種功能，因此研究ATP對膠質瘤的作用，以及其中Cav1的作用，可能在治療膠質瘤上有重要的意義。
　　 本課題旨在探討惡性膠質瘤侵襲機制的宏觀層面為出發(fā)點，研究了Cav1(Caveolin-1)、細胞外三磷酸腺苷(Adenosine Triph

6、osphate，ATP)在腦膠質瘤侵襲性生長和遷移中的作用。分析了Cav1不同表達在U87膠質瘤中生長和侵襲差異，從而為進一步研究腦膠質瘤治療提供新的思路與策略，本研究還運用時間顯微鏡成像技術，能直觀的反映出外界因素作用于U87膠質瘤細胞定向遷移現象，而且用蛋白芯片技術探討了細胞外ATP作用下，細胞蛋白表達情況，為進一步深入研究打下基礎。
　　 二、材料以及研究方法：
　　 (1)用免疫組化技術檢測U87人腦膠質瘤細胞中

7、Cav1是否為陽性表達；
　　 (2)構建Cav1慢病毒顆粒來上調或下調U87腦膠質瘤細胞中Cav1的表達；
　　 (3)應用流式細胞技術檢測Cav1過表達及干擾對U87膠質瘤細胞增殖的影響，并且應用MTT法檢測U87人膠質瘤細胞的生長曲線；
　　 (4)采用細胞“劃痕”愈合實驗和Transwell侵襲實驗方法分析Cav1上調或者下調表達后，U87腦膠質瘤細胞的體外遷移和侵襲能力。
　　 (5)細胞外AT

8、P對U87膠質瘤細胞增殖的影響，用CCK-8檢測試劑盒分別檢測了0.1%、1％、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對U87腦膠質瘤細胞的增殖情況。
　　 (6)細胞外ATP對U87膠質瘤細胞周期的影響，實驗采用流式細胞技術檢測了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質瘤細胞的生長周期。
　　 (7)細胞外ATP對U87細胞體外侵襲的影響，實驗采用Transwell侵襲實驗，以相同條件下不加ATP作為對照組，以加入100

9、μmol/LATP作為處理組，經過24h培養(yǎng)并處理小室，對跨膜細胞計數。
　　 (8)細胞外ATP對U87細胞遷移速度的影響，實驗采用時間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，其恒溫系統(tǒng)也可以很好的保持細胞活性，觀察細胞外ATP作用下對U87膠質瘤細胞遷移的影響。
　　 (9)細胞外ATP作用于U87人腦膠質瘤細胞相關蛋白質磷酸化水平，運用蛋白質芯片技術，分析了100μM ATP的10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基作用于體外培

10、養(yǎng)的U87腦膠質瘤細胞45 min后細胞運動相關蛋白質的磷酸化水平變化。
　　 三、主要研究結果：
　　 1.Cav1過表達及干擾對U87膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響
　　 (1)U87膠質瘤細胞中，Cav1呈陽性表達。
　　 (2)成功構建出U87膠質瘤細胞Cav1過表達及干擾序列。
　　 (3)Cav1過表達及干擾對U87膠質瘤細胞增殖無顯著影響。
　　 (4)劃痕試驗表明，U87細胞在

11、含10% FBS DMEM的作用下行劃痕實驗，Cav1干擾表達后，U87膠質瘤細胞遷移力明顯強于U87細胞Cav1過表達后；可是在用含有0.1% FBS培養(yǎng)基中Cav1過表達遷移力強于Cav1干擾表達。這說明Cav1對腦膠質瘤的遷移能力的作用受外界培養(yǎng)環(huán)境的影響。
　　 (5)Transwell實驗時，在含有10% FBS培養(yǎng)基中Cav1干擾表達后，U87腦膠質瘤細胞侵襲力增強，而過表達Cav1后，U87腦膠質瘤細胞侵襲力呈下降

12、(圖3)；但在含有0.1% FBS培養(yǎng)基下Cav1干擾表達后，U87膠質瘤細胞侵襲能力卻呈降低趨勢，而Cav1過表達中，U87膠質瘤細胞侵襲力增強。這說明Cav1對腦膠質瘤的侵襲能力的作用受外界環(huán)境的影響。
　　 2、細胞外ATP對U87膠質瘤的作用
　　 (1)CCK-8檢測試劑盒分別檢測了0.1%、1%、10%血清中各濃度梯度ATP作用下對U87腦膠質瘤細胞的增殖情況。結果發(fā)現，細胞外較低濃度ATP(100μM、20

13、0μM、500μM)對體外培養(yǎng)的U87膠質瘤細胞的增殖無顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對細胞呈顯著抑制作用。
　　 (2)細胞外ATP對U87膠質瘤細胞周期的影響，采用流式細胞技術檢測了不同培養(yǎng)狀態(tài)下培養(yǎng)24 h后U87人腦膠質瘤細胞的生長周期。結果發(fā)現，處理組(100μMATP)及對照組對U87腦膠質瘤細胞的生長周期無明顯影響。
　　 (3)細胞外ATP對U87細胞體外侵襲的影響，采用Transwell侵襲

14、實驗，表明一定濃度ATP可以顯著增強U87膠質瘤細胞的侵襲能力。
　　 (4)細胞外ATP對U87細胞遷移速度的影響情況，實驗采用時間顯微鏡每隔2分鐘采集照片1次，結果發(fā)現培養(yǎng)基中，100μmol/L的ATP可以顯著增強U87膠質瘤細胞的運動能力，使其遷移增強。
　　 (5)細胞外ATP作用于U87人腦膠質瘤細胞相關蛋白質磷酸化水平，實驗采用蛋白質芯片分析了與細胞運動相關蛋白質的磷酸化水平。100μM細胞外ATP作用于體

15、外培養(yǎng)的U87腦膠質瘤細胞45min后VASP(Ab-238)和Rac1/cdc42(Ab-71)信號通路活化
　　 四、結論
　　 本課題研究了Cav1在U87腦膠質瘤細胞生長和侵襲中的作用；以及細胞外ATP對U87人膠質瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用；建立了細胞外ATP作用下直觀觀察細胞運動的系列裝置，觀察了細胞外ATP對體外培養(yǎng)的U87腦膠質瘤細胞遷移的影響。結論如下：
　　 Cav1在高級別腦膠質瘤中的表達

16、顯著增高，Cav1的表達越高，病人的預后越差；Cav1對U87人腦膠質瘤細胞增殖無任何作用。
　　 2、Cav1在U87人腦膠質瘤細胞增中呈陽性表達，對U87人腦膠質瘤細胞侵襲和遷移中的作用具有細胞差異并受腫瘤細胞生長環(huán)境的影響。在細胞外營養(yǎng)充足時，Cav1過表達抑制U87膠質瘤細胞的侵襲。在營養(yǎng)相對缺少的情況下，Cav1過表達增強U87膠質瘤細胞的侵襲能力。
　　 3、細胞外較低濃度ATP(100μM、200μM、50

17、0μM)對體外培養(yǎng)的U87膠質瘤細胞的增殖無顯著影響，但較高濃度ATP(5000μM)對細胞呈顯著抑制作用。
　　 4、細胞外ATP(100μM)可以顯著增強U87膠質瘤細胞的侵襲能力。
　　 5、運用時間顯微鏡及觀察裝置，可以直觀看出細胞外一定濃度ATP(100μM)可以增強U87膠質瘤細胞的遷移能力。
　　 6、蛋白芯片技術表明ATP作用于U87膠質瘤細胞可以顯著增強VASP(Ab-238)和Rac1/cdc

18、42(Ab-71)信號通路活化。
　　 有研究指出膠質瘤細胞對細胞外ATP的降解速度遠低于膠質細胞，且膠質瘤細胞所處的微環(huán)境中ATP的濃度升高；細胞外ATP濃度升高對正常腦組織有細胞毒性作用，而膠質瘤細胞不但耐受性高，而且細胞外的ATP還可促進膠質瘤細胞的生長和侵襲。本課題研究探討了Cav1在U87腦膠質瘤侵襲中的作用及表達情況，通過細胞外ATP對U87膠質瘤細胞的作用，明確了腦膠質瘤侵襲性生長的機制，蛋白芯片技術研究為進一步探