基于中醫(yī)整體觀念治法治則下的端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸聯合作用對肺癌細胞端粒的影響及機制研究.pdf

1、惡性腫瘤，這種由于多種環(huán)境因素長期共同作用所產生的多基因疾病，在現代醫(yī)學注重對單基因、單靶點的對抗性治療下難以取得良好的效果。然而中醫(yī)講究整體、注重變化、注重平衡、辨證施治等基礎理論的挖掘，不但可以解決諸如惡性腫瘤等復雜多基因疾病的問題，而且可以促進現代醫(yī)學向更高境界發(fā)展。 中醫(yī)整體觀念的治法治則為解決腫瘤分子生物學端?？拱┌悬c的難題提供了良好的思路。 端粒是真核生物細胞染色體末端的特殊核酸蛋白結構，能保護染色體末端，以

2、維持染色體結構的穩(wěn)定。端粒長度的復制性縮短是通過端粒酶的逆轉錄合成來修復的，而端粒長度的維持對于腫瘤細胞保持無限增殖的永生化傾向至關重要。因此，通過抑制端粒酶來控制腫瘤是近年來國內外學者關注的熱點之一．然而，理論推理的邏輯性和實驗室工作的初步結果并沒有給臨床帶來滿意的效果。因為從整體的角度，除了端粒酶之外，還有眾多的端粒相關蛋白因子參與端粒的調控；從平衡的角度，單獨的端粒酶抑制是一種不完全的抑制。 從理論上看，端粒結合蛋白1(T

3、RF1)通過抑制端粒酶與端粒相互作用而對端粒長度起負向調節(jié)作用；而端錨酶能使TRF1發(fā)生ADP核糖基化而抑制其與端粒重復片段結合，是端粒長度的正向調節(jié)因子。端錨酶、端粒酶同時與TRF1相聯系，兩者的聯合則有可能成為腫瘤基因治療的一個靶點。 為此，首先構建端錨酶反義寡核苷酸和反義端粒酶催化亞單位寡核苷酸，以其相應的正義寡核苷酸為對照，采用脂質體法將其導入端粒酶陽性的人肺腺癌細胞A549，觀察反義寡核苷酸對A549細胞端粒動力學的影

4、響、與Bcl-2凋亡基因家族的相互聯系及反義寡核苷酸作用下A549細胞形態(tài)、功能的改變，探討端錨酶、端粒酶聯合作為腫瘤基因治療的可能性和機理，為日后腫瘤基因治療提供可靠的實驗室數據和充足的理論準備。 目的 1.觀察端錨酶，端粒酶兩種反義寡核苷酸聯合作用對端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA轉錄、端粒酶及端錨酶蛋白質表達水平的影響；探討兩種反義寡核苷酸作用對細胞端粒長度的影響。 2.探討兩種反義寡核苷酸與Bcl-

5、2凋亡基因家族相互作用的聯系，收集其基因學證據。 3.觀察兩種反義寡核苷酸持續(xù)作用下A549細胞形態(tài)學的改變，細胞傳代與端?？s短之聞的相互關系，細胞氚攝取率及X-Gal轉染率等功能學改變，探討其腫瘤基因治療的潛在價值． 方法與結果： 1.運用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)對A549細胞端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA表達進行檢測。結果發(fā)現：端粒酶催化亞單位反義寡核苷酸(ashTERT)下調hTERT

6、mRNA的轉錄；而端錨酶正、反義寡核苷酸(sTANKS、asTANKS)不影響其轉錄；端粒酶催化亞單位及端錨酶反義寡核苷酸聯合(ashTERT+asTANKS)時hTERT mRNA的轉錄水平無額外的變化． 2.采用多聚合酶鏈一酶聯免疫吸附實驗(PCR-ELISA)定量分析端粒酶活性。結果顯示：ashTERT明顯抑制端粒酶活性；asTANKS、sTANKS作用下端粒酶活性無明顯變化；asTANKS與ashTERT聯合作用下端粒酶

7、活性亦無明顯額外變化。 3.采用Western Blot法檢測端錨酶活性顯示：asTANKS明顯抑制端錨酶活性;ashTERT、shTERT作用下端錨酶活性無明顯變化；ashTERT與asTANKS聯合作用下端錨酶活性亦無明顯額外變化。 4.通過定量熒光原位雜交法(Q-FISH)上流式細胞儀檢測A549細胞端粒長度。結果顯示：與sTANKS、shTERT比較，asTANKS、ashTERT均可導致細胞端粒長度的明顯縮短；

8、而asTANKS+ashTERT的聯合作用使細胞端粒長度的縮短更為明顯，兩者有協同作用。 5.以RT-PCR法分析反義寡核苷酸作用下A549細胞mcl-1、Bcl-2和Bax基因的轉錄水平發(fā)現：ashTERT不影響上述三種基因的轉錄水平：asTANKS除上調mcl-1基因的轉錄外，對Bcl-2和Bax基因無影響；并且asTANKS的此種作用不因ashTERT的聯合而發(fā)生改變。 6.Western Blot法檢測Mel-1

9、、Bcl-2及Bax蛋白活性顯示：ashTERT對Mcl-1總蛋白活性無影響，但可使蛋白短拼接體的(Mcl-1s)含量下降；ashTERT對Bcl-2、Bax蛋白的表達無影響。asTANKS上調Mcl-1蛋白的表達，并且上調Mcl-1s的比例；對Bcl-2、Bax蛋白的表達無影響。asTANKS+ashTERT的聯合作用可逆轉Mcl-1s含量的下降，促進Mcl-1s、Mcl-1總蛋白活性的上調。 7.普通光學顯微鏡及熒光顯微鏡觀

10、察，經asTANKS、ashTERT作用的細胞在形態(tài)學上漸出現細胞衰老的征象，并且在后期的傳代試驗中細胞凋亡的比例漸增；而asTANKS+ashTERT聯合作用時細胞衰老和凋亡的特征更明顯。 8.細胞傳代實驗的結果顯示：經asTANKS、ashTERT處理后的細胞傳代時間明顯延遲，細胞增殖周期明顯縮短；而asTANKS+ashTERT聯合作用時細胞增殖周期的縮短更為明顯，兩者有協同作用。 9.經asTANKS、ashTE

11、RT處理后的細胞氚攝取率隨細胞傳代的進行逐漸下降，并且asTANKS+ashTERT聯合作用組細胞氚攝取率降低更為明顯，作為sTANKS、shTERT對照組的細胞氚攝取率無明顯改變． 10.經asTANKS、ashTERT處理后的細胞細胞X-Ga1轉染率隨細胞傳代的進行逐漸升高，并且asTANKS+ashTERT聯合作用組細胞X-Ga1轉染率升高更為明顯，作為sTANKS、shTERT對照組的細胞X-Ga1轉染率無明顯改變。

12、 結論 1.基于中醫(yī)學整體平衡觀念的治法治則對于解決惡性腫瘤端?？拱┌悬c的難題具有明顯的指導意義。 2.端錨酶反義寡核苷酸通路是完全有別于端粒酶的端粒抑制途徑，其縮短細胞端粒長度的作用發(fā)揮有賴于減少自身端錨酶的活性。 3.端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸在加速細胞端粒長度的縮短、促進腫瘤細胞衰老、凋亡方面具有協同作用。 4.端錨酶和端粒酶反義寡核苷酸協同作用的機理可能與mcl-1基因在轉錄及轉錄后水平的上調