葡萄籽原花青素B2對db-db小鼠主動脈保護機制的研究.pdf

1、第一章GSPB2對db/db小鼠主動脈保護作用的蛋白質組學研究
　　 研究背景:
　　 糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素抵抗伴有相對胰島素不足或胰島素分泌缺陷而導致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病。隨著社會經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，生活方式的改變和社會人口老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內呈上升趨勢，已經成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題，

2、也成為世界各國致死、致殘并造成醫(yī)療開支增高的主要原因。糖尿病不僅以持續(xù)性的高血糖為其特點，更重要的是高血糖以及合并的代謝紊亂引起的多系統(tǒng)損害，諸如心臟、血管、腎臟、神經、視網膜、周圍神經、腦等組織器官的慢性進行性病變。
　　 糖尿病主動脈病變是糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，是糖尿病患者的主要死因。糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的危險提高了2-4倍，糖尿病已經作為冠心病等危癥越來越受到人們的重視。糖尿病主動脈病變

3、以不斷進展的動脈粥樣硬化及血管重構為特征，是糖尿病心血管并發(fā)癥的主要病理學基礎。其發(fā)病機制尚不清楚，治療手段也不完善。因此，在臨床實踐中迫切需要尋找糖尿病主動脈病變的內在分子機制與新型治療藥物，進一步完善與充實DM主動脈病變的治療策略。
　　 天然藥物葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是從葡萄籽中提取的一種天然多酚類化合物，主要是以兒茶素或表兒茶素為單體縮合而成的聚

4、合物，其中以低聚體（二聚、三聚、四聚體）生物活性最強。葡萄籽原花青素B2(GSPB2)是GSPE的主要成分，其生物活性在GSPE的多種成分中最強。有研究表明，GSPB2具有抗炎、抗凋亡、抗AGEs誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移的作用。既往研究表明，GSPE對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠的主動脈具有明確的保護作用。然而，此保護作用的分子機制還不完全清楚。隨著蛋白質組學技術的發(fā)展，一種基于質譜的蛋白質組

5、定量分析技術即同位素標記的相對和絕對定量技術(isobaric tag for relative and absolutequantitation，iTRAQ)以其獨特的優(yōu)越性，正逐漸成為定量研究中的主要方法之一。iTRAQ技術可對一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜的混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定，尋找差異表達蛋白，并分析其蛋白功能。其已經在探討疾病發(fā)生機制、疾病標志物的尋找和不同時段或者不同狀態(tài)的多樣本定量分析等蛋白質組學

6、研究領域得到了很好的應用。為了進一步探討GSPB2對2型糖尿病主動脈損傷的保護作用及其作用靶點，本研究采用國際上公認的2型糖尿病模型小鼠——db/db小鼠為研究對象，對經GSPB2干預的db/db小鼠的主動脈進行iTRAQ蛋白質組學分析，尋找正常對照組（CC組），db/db小鼠組(DM組)與db/db小鼠GSPB2治療組（DMT組）主動脈的差異表達蛋白，旨在揭示GSPB2對于db/db小鼠主動脈病變的保護機制，為臨床糖尿病患者血管并發(fā)癥

7、的治療尋求更為有效的藥物提供候選靶點。
　　 研究目的:
　　 1.研究db/db小鼠主動脈病變的特點，觀察18周齡各組小鼠主動脈組織的病理學和超微結構變化;
　　 2.應用iTRAQ蛋白質組學技術研究db/db小鼠主動脈損傷與正常小鼠主動脈的差異表達蛋白，明確糖尿病大血管病變的病理生理機制;
　　 3.研究db/db小鼠經GSPB2治療后主動脈的差異表達蛋白，篩選藥物候選靶點，進一步揭示GSPB2對糖尿

8、病主動脈的保護機制。
　　 研究方法:
　　 7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只及7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只，適應性飼養(yǎng)1周。實驗開始后，C57BLKS/J db/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，C57BLKS/J db/db小鼠隨機分為兩組:8只DM模型組(DM)，每日予生理鹽水灌胃;8只為GSPB2干預組(DMT)，GSPB2溶于與DM組相同體積生理鹽水，以30 mg/kg/d灌

9、胃，共進行10周。
　　 1.體重、FBG、TC、TG和AGEs的測定:實驗期間每周定期測量體重(bodyweight，BW)并記錄。實驗周期結束，所有小鼠空腹過夜并處死，采血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)等

10、指標。
　　 2.主動脈組織形態(tài)學和超微結構觀察:迅速剝離主動脈，用多聚甲醛或戊二醛固定，HE染色觀察主動脈病理變化，測量主動脈內中膜厚度;應用透射電鏡觀察主動脈組織超微結構變化。
　　 3.蛋白質組學（iTRAQ）分析:分別選取CC組、DM組和DMT組小鼠各4只，提取主動脈總蛋白。各組主動脈總蛋白采用FASP酶解得到相應肽段。各組取60μg肽段，按照ABI公司說明書操作與標記肽段，114標記正常對照組，115標記GSP

11、B2干預組，117標記db/db糖尿病組。將各組已標記的肽段混合后用強陽離子交換柱（strong cation exchange，SCX）和C18柱進行分離，用串聯(lián)質譜方法對在第一級質譜檢測到前體離子進行碰撞誘導解離，產物離子通過第二級質譜進行分析。不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對豐度。原始文件(raw file)用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用SEQUE

12、ST軟件鑒定多肽分子。最后，使用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件將定量及鑒定結果進行合并處理，得到定量和鑒定結果。采用軟件計算的ratio_biweight值作為蛋白質定量結果，以114標記為內參。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為IPI mouse(international protein index，version3.72)蛋白數(shù)據(jù)庫。
　　 4.蛋白質定位分析、功能分析及相互作用網絡分析:采用GO

13、分類工具（http://www.geneontology.org, VERSION1.8）和KOGnitor(eukaryotic orthologousgroups)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/grace/kognitor.html）分析對經鑒定的主動脈蛋白質表達譜進行定位分類與功能分析。應用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)軟件進行生物信息學分析。
　　 5

14、.蛋白質免疫印跡方法(Western blot):部分主動脈組織采用western blot方法檢測鑒定出的乳凝集素(milk fat globule epidermal growth factor-8，MFG-E8)、谷胱甘肽S-轉移酶(gultathione S transferases theta-1，GSTT1)和半胱氨酸甘氨酸富集蛋白1(cysteine and glycine-rich protein1，CSRP1)的蛋白表

15、達水平以驗證蛋白質組學的可靠性。
　　 研究結果:
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長以及精神狀況良好，活躍，毛發(fā)光順。DM組小鼠實驗進程中，逐漸表現(xiàn)為污穢無澤，被毛蓬松，少動，明顯多飲、多食、多尿，體重快速增加。DMT組小鼠上述表現(xiàn)有所減輕。
　　 2.GSPB2對db/db小鼠體重、FBG、TC、TG和AGEs的影響
　　 實驗前DM組與DMT組的體重差異并無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，

16、但均顯著高于CC組(p＜0.01)。自實驗第2周開始，DM組小鼠體重逐漸增加，一直持續(xù)至實驗結束（小鼠18周齡）。DMT組小鼠與DM組相比，GSPB2能夠顯著改善DM小鼠的體重(p＜0.01)。
　　 實驗開始時DM組與DMT組間的FBG水平無顯著性差異(p＞0.05)，但與CC組比較，兩組FBG水平均明顯升高(p＜0.01)。給予GSPB2干預10周后，DMT組小鼠的FBG水平與DM組相比輕微下降，但無顯著性差異(p＞0.05

17、)。
　　 實驗結束時測量血清TC、TG和AGEs。DM組的TC、TG和AGEs與CC組相比明顯升高(p＜0.01)。GSPB2干預10周后，TC、TG和AGEs水平明顯下降(p＜0.01)。
　　 3.GSPB2對主動脈組織形態(tài)學的影響
　　 HE染色:光鏡下CC組主動脈內膜光滑，內皮細胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊，中膜主要由同心排列的彈性纖維組成，無增厚;DM組主動脈壁層次不清，內皮細胞損傷、突起、形態(tài)不規(guī)則，中膜明

18、顯增厚，平滑肌細胞增生。DMT組內皮細胞損傷減輕，中膜增厚明顯減輕，平滑肌細胞和彈性纖維排列較規(guī)則。
　　 4.GSPB2對主動脈超微結構的影響
　　 電鏡下CC組主動脈內皮細胞形態(tài)正常，平滑肌細胞核染色質分布正常，可見線粒體、內質網、高爾基復合體等細胞器，形態(tài)正常。DM組內皮細胞損傷，可見插入的平滑肌細胞;彈力膜斷裂，管壁膠原纖維增多;平滑肌細胞核固縮，異染色質增多;線粒體固縮，棒狀線粒體出現(xiàn);內質網腫脹。DMT組內皮

19、下結構基本正常，平滑肌細胞插入和細胞器異常明顯減輕。
　　 5.iTRAQ質譜鑒定結果
　　 本研究經質譜鑒定蛋白1530個。CC組和DM組小鼠主動脈差異表達蛋白557個（±1.5倍），其中糖尿病小鼠主動脈組織表達上調的點463個，下調的點94個，經GSPB2治療后回調的蛋白139個。
　　 6.GSPB2干預后差異蛋白的定位分析
　　 對質譜鑒定得出的139個差異蛋白點（DM組和DMT組之間）經過蛋白質

20、組學工具分析，差異表達蛋白定位主要包括胞漿蛋白(40％)，胞核蛋白(18.8％)，胞膜蛋白(12.1％)，內質網蛋白(7.9％)，線粒體蛋白(7.3％)，分泌蛋白(6.7％)，中心體蛋白(6.0％)，核糖體蛋白(3.0％)，高爾基體蛋白(2.4％)和溶酶體蛋白(1.2％)。
　　 7.GSPB2干預后差異蛋白的功能分析
　　 對質譜鑒定得出的139個差異蛋白點（DM組和DMT組之間）進行功能分析。差異表達蛋白功能主要包括

21、信號轉導蛋白(17％)，細胞骨架蛋白(12％)，翻譯后修飾、蛋白轉換和分子伴侶蛋白(9％)，翻譯、核糖體結構蛋白(7％)，細胞內運輸、分泌蛋白(6％)，細胞周期、細胞分化蛋白(4％)，核苷酸的轉運和代謝蛋白(4％)，脂質轉運和代謝蛋白(4％)。還有一部分蛋白分布于13個其他功能類別。
　　 8.差異表達蛋白的IPA分析
　　 應用IPA軟件將差異表達蛋白進行PATHWAY分析，分別繪制包括細胞凋亡、氧化應激和脂質代謝等通

22、路，這些通路有利于更好的理解糖尿病血管重塑的分子機制及GSPB2的干預靶點。
　　 9.篩選部分差異蛋白在主動脈組織的表達改變
　　 為驗證蛋白質組學鑒定出的部分差異蛋白在主動脈組織的表達，應用Western blot方法檢測其中差異蛋白如MFG-E8、GSTT1和CSRP1在各組小鼠主動脈組織中的表達。結果顯示，與正常對照組小鼠比較，MFG-E8和CSRP1在DM小鼠中表達明顯增高(p＜0.01)，應用GSPB2治療后

23、，表達增高的蛋白有所下調(p＜0.01)。另外，GSTT1在DM小鼠中表達中與正常對照組比較表達后明顯降低(p＜0.01)，經過GSPB2干預后該蛋白表達回調(p＜0.01)。該結果與iTRAQ鑒定結果是一致的。這些蛋白為我們將來的深入研究提供了思路。
　　 結論:
　　 1.與正常對照組比較，db/db小鼠體重顯著增加，GSPB2干預可以顯著改善db/db小鼠的肥胖趨勢。
　　 2.與正常對照組比較，db/db

24、小鼠的FBG、TC、TG和AGEs水平顯著升高，經GSPB2治療后能夠顯著降低其TC、TG與AGEs水平。
　　 3.光鏡和電鏡顯示:db/db小鼠主動脈內皮損傷，平滑肌增殖，血管重塑，各種細胞器異常，GSPB2能夠顯著改善db/db小鼠主動脈損傷。
　　 4.作為定量蛋白質組學的新技術iTRAQ具有高靈敏性、高通量的特點，能夠對多組樣本同時進行比較分析。因此，iTRAQ可用于研究GSPB2對db/db小鼠主動脈保護作用

25、的分子機制，尋找新的藥物靶點，獲得可靠的各組差異表達蛋白。
　　 5.質譜鑒定CC組和DM組小鼠主動脈差異表達蛋白557個，其中DM組主動脈組織表達上調的點463個，下調的點94個，經GSPB2治療后回調的蛋白139個。以胞漿蛋白為主，其功能涉及細胞凋亡、氧化應激和脂質代謝，提示這些過程參與了T2DM主動脈病變的發(fā)生發(fā)展。
　　 6.Western blot驗證結果顯示，與CC組比較，MFG-E8和CSRP1在DM組小鼠

26、主動脈中表達明顯增高，應用GSPB2治療后，表達增高的蛋白有所下調。GSTT1在DM組小鼠中表達中與正常對照組比較表達后明顯降低，經過GSPB2干預后該蛋白表達回調。這為深入研究GSPB2對主動脈的保護作用提供了關鍵的候選靶點。
　　 第二章GSPB2對db/db小鼠主動脈的保護機制及對MFG-E8的干預研究
　　 研究背景:
　　 隨著人類基因組計劃的完成，生命科學研究已進入了后基因組時代。蛋白質是生理功能的執(zhí)

27、行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。傳統(tǒng)的對單個蛋白質進行研究的方式已無法滿足后基因組時代的要求。不同生理和病理狀態(tài)下蛋白質的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，因此要對生命的復雜活動有全面和深入的認識，必然要在整體、動態(tài)、網絡的水平上對蛋白質進行研究。蛋白質組學的研究是其中的關鍵內容之一。但蛋白質組學對成百上千的蛋白質的識別只是這一過程的初始階段，對大量的差異蛋白進行數(shù)據(jù)分析和篩選，進行

28、功能驗證以及研究其相互作用和信號通路，從而確定潛在的靶點才是其核心內容。
　　 葡萄籽原花青素B2(GSPB2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑之一?？寡趸扒宄杂苫哪芰εc其分子結構中含有較多的酚羥基，并與其特定分子立體化學結構密切相關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GSPB2能夠抑制AGEs誘導的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的產生和血管平滑肌細胞的增殖;GSPE對1型糖尿病大鼠主動脈具

29、有明確的保護作用。但是對2型糖尿病主動脈的保護機制尚未深入研究，其分子靶點也尚未明確。傳統(tǒng)意義上的藥物研究往往注重藥物表型的觀察與單個大分子或酶解的活性，無法實現(xiàn)對于藥物作用的靶點的全面分析。而隨著定量蛋白質組學與藥學研究的共同發(fā)展與結合，為藥物高效率開發(fā)與利用帶來了新的希望。本研究第一部分采用iTRAQ蛋白質組學技術，鑒定出CC組與DM組的差異蛋白557個，經GSPB2治療后，此差異蛋白回調139個。我們根據(jù)已有知識、數(shù)據(jù)庫注釋和文獻

30、資料進行篩選，發(fā)現(xiàn)其中MFG-E8蛋白表達DM組升高，GSPB2治療后表達降低，在DM/CC中的比值為2.41，DMT/DM的比值為0.59。
　　 MFG-E8是最早在乳脂球表面發(fā)現(xiàn)的一種親脂性糖蛋白，在很多組織細胞中均有表達。有研究表明，MFG-E8在炎癥損傷及動脈斑塊中有表達;MFG-E8隨年齡增長而顯著增高;在對乳腺癌及膀胱癌等腫瘤的研究中，體內MFG-E8的表達升高。但在糖尿病及其靶器官病變中，MFG-E8的作用尚未明

31、確。因此，本研究擬在蛋白質組學鑒定的基礎上，進一步研究MFG-E8對糖尿病主動脈損傷的作用，在2型糖尿病模型db/db小鼠體內采用慢病毒介導的RNA干擾技術降低體內MFG-E8蛋白的表達，以及體內注射重組MFG-E8蛋白增加小鼠MFG-E8蛋白表達，觀察MFG-E8對T2DM主動脈的作用，研究其內在機制，從而為臨床早期監(jiān)測和干預，以及T2DM主動脈并發(fā)癥的治療提供新的藥物靶點。
　　 研究目的:
　　 1.深入研究GSP

32、B2對db/db小鼠主動脈的保護機制，進一步明確糖尿病大血管病變的病理生理機制;
　　 2.構建MFG-E8慢病毒干擾載體，以及體內注射重組蛋白過表達MFG-E8，研究MFG-E8降低或升高對主動脈病理學和超微結構變化的作用，并深入研究MFG-E8參與糖尿病主動脈損傷的作用機制。
　　 研究方法:
　　 1.主動脈內皮細胞原代培養(yǎng):8周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠剝離主動脈進行主動脈內皮細胞原代培養(yǎng)。將

33、主動脈縱行剪開，平展在平皿內，用手術刀將其切成2mm×2mm小動脈片，然后貼入無菌的細胞培養(yǎng)瓶中，動脈內膜面與培養(yǎng)瓶玻璃面接觸，加入5 ml含20％胎牛血清的內皮細胞培養(yǎng)基(ECM)，放于37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-9天細胞形成細胞單層，用0.25％的胰酶消化傳代。使用3-6代細胞用于研究。
　　 2.慢病毒干擾載體的構建及細胞內轉染:構建針對小鼠MFG-E8基因4個靶點的慢病毒干擾載體，并構建含GFP的載體作為對照載體

34、。分別在MOI（multiplicity of infection）50、75、100的情況下進行轉染主動脈內皮細胞，并于12h、24 h、48 h和72 h在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。確定最佳MOI值為100。轉染3天后，收集細胞使用western blot檢測MFG-E8蛋白表達下調水平，篩選出干擾效率最高的靶點。大規(guī)模包裝此靶點病毒，進行db/db小鼠體內實驗。
　　 3.db/db小鼠體內實驗研究MFG-E8缺失與過表達

35、對主動脈的影響:7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠32只及7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只，適應性飼養(yǎng)1周。實驗開始后，C57BLKS/J db/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，C57BLKS/J db/db小鼠隨機分為四組:8只DM模型組(DM);8只為GFP干預組(GFP)，于小鼠14周給予GFP尾靜脈注射一次;8只為MFG-E8慢病毒干擾載體干預組(M-RNAi)，于小鼠14周給予LV-MFG-E8尾靜脈

36、注射一次;8只為重組MFG-E8蛋白干預組(rmMFG-E8)，從小鼠14周開始，每周兩次尾靜脈注射MFG-E8重組蛋白(20μg/kg)，共4周。
　　 4.MFG-E8干預對主動脈組織形態(tài)學及超微結構的影響:實驗周期結束，所有小鼠禁食12h后處死，迅速剝離主動脈，多聚甲醛或戊二醛固定，HE染色觀察主動脈病理變化，測量主動脈內中膜厚度;應用透射電鏡觀察主動脈組織超微結構變化。
　　 5.MFG-E8干預對主動脈MFG-

37、E8和p-ERK蛋白表達的影響:部分主動脈組織分離后立即投入液氮，然后-80℃保存。Western blot檢測主動脈MFG-E8和p-ERK蛋白表達情況。
　　 6.MFG-E8干預對血清MCP-1表達的影響:采血并分離血清，檢測各組血清MCP-1表達情況。
　　 研究結果:
　　 1.MFG-E8對主動脈組織形態(tài)學的影響
　　 HE染色:光鏡下CC組主動脈內膜光滑，內皮細胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊，中膜主要

38、由同心排列的彈性纖維組成，無增厚;DM組和GFP組主動脈壁層次不清，內皮細胞損傷、突起、形態(tài)不規(guī)則，中膜明顯增厚，平滑肌細胞增生;M-RNAi組內皮細胞損傷減輕，中膜增厚明顯減輕，平滑肌細胞和彈性纖維排列較規(guī)則;rmMFG-E8組較DM組損傷更為明顯，內皮細胞腫脹，血管壁增厚，炎癥細胞如中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，并有局部壞死。
　　 2.MFG-E8對主動脈超微結構的影響
　　 電鏡下CC組主動脈內皮細胞形態(tài)正常，平滑肌

39、細胞核染色質分布正常，可見線粒體、內質網、高爾基復合體等細胞器，形態(tài)正常;DM組和GFP組內皮細胞損傷，可見插入的平滑肌細胞;彈力膜斷裂，管壁膠原纖維增多;平滑肌細胞核固縮，異染色質增多;線粒體固縮，棒狀線粒體出現(xiàn);內質網腫脹;M-RNAi組內皮下結構基本正常，平滑肌細胞插入和細胞器異常明顯減輕;rmMFG-E8組較DM組病變加重，并可見更多的異染色質和異常細胞器，平滑肌細胞遷移入內彈力膜。
　　 3.MFG-E8干預對主動脈M

40、FG-E8蛋白表達的影響
　　 Western blot分析表明，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組主動脈組織MFG-E8的蛋白表達水平明顯升高(p＜0.01);M-RNAi干擾組MFG-E8表達較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的蛋白表達較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 4.GSPB2和MFG-E8干預對主動脈p-ERK蛋白表達的影響
　　 Western blot分析表明

41、，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組主動脈組織p-ERK的蛋白表達水平明顯升高(p＜0.05或p＜0.01);GSPB2治療顯著抑制p-ERK的蛋白表達水平(p＜0.01);M-RNAi干擾組p-ERK表達較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的p-ERK蛋白表達較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 5.GSPB2和MFG-E8干預對血清MCP-1表達的影響
　　 ELISA法檢測血清MCP

42、-1表達情況顯示，與正常組小鼠相比，DM組和GFP組MCP-1的表達水平明顯升高(p＜0.01);GSPB2治療顯著抑制MCP-1的表達(p＜0.01);M-RNAi干擾組MCP-1表達較GFP組明顯降低(p＜0.01);而重組蛋白rmMFG-E8組的MCP-1表達較DM組明顯升高(p＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.構建了可靠的慢病毒MFG-E8干擾載體，并在細胞及動物水平驗證了其轉染效率。
　　 2.G

43、SPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著抑制體內MFG-E8蛋白表達，從而減輕2型糖尿病主動脈的損傷;而體內注射MFG-E8重組蛋白加重主動脈損傷程度。
　　 3.GSPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著降低主動脈組織p-ERK蛋白表達;而體內注射MFG-E8重組蛋白增加主動脈p-ERK蛋白表達。
　　 4.GSPB2和慢病毒MFG-E8干擾載體能夠顯著降低血清MCP-1表達;而體內注射MFG-E8重組蛋白增加