沙利度胺對人膠質瘤細胞U251的體外作用及其機制的研究.pdf

1、目的：通過體外實驗觀察沙利度胺對人神經膠質瘤細胞U251增殖及對缺氧誘導因子HIF-1、血管內皮生長因子VEGF和對鈣離子Ca2+濃度的影響，進一步闡明沙利度胺抗腫瘤、抗血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制，同時觀察沙利度胺聯(lián)合順鉑對U251細胞的作用。 方法： 1、選取人神經膠質瘤U251細胞系進行體外培養(yǎng)，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測沙利度胺不同濃度組(10、25、50、100μg/ml)、不同時間組(24、4

2、8、72h)對U251細胞存活和生長的影響情況。流式細胞儀測定沙利度胺對U251細胞周期分布和凋亡的影響。 2、根據(jù)MTT的結果，設置對照及實驗組，分別提取各組細胞總RNA，鑒定其完整性及含量，通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(revers transcription PCR，RT-PCR)半定量檢測沙利度胺處理前后U251細胞中HIF-1和VEGFmRNA的表達水平。采用流式細胞術(flowcytometry，F(xiàn)CM)定量檢測沙利度胺

3、處理前后U251細胞周期分布和凋亡及對HIF-1和VEGF蛋白表達的影響。 3、采用MTT比色法檢測沙利度胺與抗癌藥物順鉑聯(lián)合應用后對U251細胞的增殖抑制作用，測定其吸光度(OD)值，并采用isobolanalysis公式分析相互作用指數(shù)(Iteraction Index)，評價兩藥聯(lián)合后的作用，如相互作用指數(shù)>1為兩藥拮抗作用；相互作用指數(shù)=1為兩藥相加作用；相互作用指數(shù)<1為兩藥協(xié)同作用。 4、利用激光共聚焦顯微鏡

4、觀察沙利度胺不同濃度組(10、25、50、100μg/ml)作用72h后U251細胞中Ca2+熒光強度的變化。 結果： 1、MTT結果顯示：沙利度胺在(10～100)μg/ml濃度范圍內能明顯抑制U251細胞體外增殖，隨著時間、濃度增加抑制率相應升高，以100μg/ml組作用72h抑制率最高。與對照組相比，不同濃度組對U251細胞抑制率差異均具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。沙利度胺處理細胞48、72h，IC50分別

5、為51.62μg/ml、35.76μg/ml。流式細胞儀檢測U251細胞周期分布和凋亡顯示，10、25、50、100μg/ml沙利度胺作用U251細胞72h，隨藥物濃度增大，G0/G1期細胞逐漸增多;S期、G2/M期細胞則逐漸減少。即沙利度胺可阻滯U251細胞周期進程于G1期，該作用呈劑量-效應依賴關系。10、25、50、100μg/ml沙利度胺處理細胞72h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依沙利度胺濃度增大而逐漸升高；凋亡百分率分別為：

6、9.31％、14.53％、19.36％、28.30％，較對照組有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2、半定量RT-PCR檢測結果顯示：沙利度胺不同濃度組處理U251細胞72h后，HIF-1和VEGFmRNA都有不同程度的降低。100μg/ml沙利度胺濃度組作用72h對U251細胞HIF-1和VEGF mRNA表達抑制最顯著，比較沙利度胺處理前HIF-1和VEGFmRNA表達水平差異具有顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。流式細胞

7、術檢測結果顯示：0、10、25、50、100μg/ml沙利度胺處理U251細胞72h后U251細胞中HIF-1蛋白表達熒光指數(shù)(FI值)分別為1.719、1.645、1.329、1.202、1.081，VEGF蛋白表達熒光指數(shù)(FI值)分別為2.248、1.976、1.553、1.337、1.097。比較處理組和對照組的FI值，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以100μg/ml、72h對HIF-1和VEGF抑制最顯著，與RT-PCR

8、結果一致。 3、MTT比色法分析沙利度胺聯(lián)合順鉑對U251細胞的增殖抑制作用，結果顯示：沙利度胺可加強順鉑對U251細胞的增殖抑制作用。在10～100μg/ml范圍內，隨沙利度胺濃度的增大，其對順鉑的協(xié)同作用增強。單用順鉑的IC50為22.31μg/ml，聯(lián)合10、25、50μg/ml沙利度胺后可將順鉑的IC50分別降低至9.62、4.68、2.41μg/mlμg/ml。因此，在一定濃度范圍內，沙利度胺可協(xié)同順鉑抑制U251細胞

9、的生長增殖。 4、Isobolanalysis分析相互作用指數(shù)顯示，沙利度胺聯(lián)合順鉑在細胞生長抑制率為50％時的相互作用指數(shù)為0.86，證明沙利度胺確實可協(xié)同順鉑對U251細胞的增殖抑制作用。 5、激光共聚焦顯微鏡檢測結果示：沙利度胺在10～100μg/ml濃度范圍內能明顯使U251細胞內Ca2+熒光強度逐漸增強，即鈣離子逐漸濃度升高，且隨著沙利度胺濃度增加Ca2+濃度相應升高，以100μg/ml組作用72h后細胞中Ca

10、+熒光強度最高。 結論： 1、本實驗證實在一定濃度范圍內，沙利度胺能夠抑制U251膠質瘤細胞增殖，并呈濃度一時間依賴關系。 2、沙利度胺可阻滯膠質瘤細胞U251于G1期并可誘導該細胞凋亡，誘導細胞凋亡是其抗腫瘤作用機制之一。 3、一定濃度的沙利度胺能夠在mRNA和蛋白水平抑制U251細胞中HIF-1和VEGF表達。 4、沙利度胺可以使U251細胞內Ca2+濃度升高，證明其具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用