胚胎后腎組織體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化實驗研究.pdf

1、背景和目的： 慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率不斷增加，在成人中的發(fā)生率已達10％，其主要特征是細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過度沉積和纖維化，引起腎功能進行性下降，發(fā)展的最終結(jié)局是終末期腎衰(end stage renal disease，ESRD)，目前只能依賴血透、腹透和腎移植來治療。血透、腹透只能部分替代腎臟的濾過功能。腎移植供體短缺、抗排異藥物副

2、作用大，這些治療方法均存在嚴重缺陷。尋找更完美的新治療方法和途徑是腎臟病工作者迫在眉睫的任務(wù)。 近來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有高度可塑性(plasticity)，在體的胚胎組織可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞(renal stem cells)或腎臟固有細胞分化，異種胚胎組織也可誘導(dǎo)入骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞或腎臟固有細胞分化，但在胚胎內(nèi)誘導(dǎo)

3、骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化無臨床應(yīng)用前景，因為難以從胚胎組織中分離純化由骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來的腎干細胞。如果能在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為腎干細胞，則誘導(dǎo)的細胞可被輕而易舉地分離和純化，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 大量資料表明，干細胞的分化發(fā)育及其發(fā)育方向，取決于其所處的微環(huán)境(microenvironment)。在后腎發(fā)育過程中，后腎間充質(zhì)細胞(metanephric mesenchymecells，MMCs)即胚腎

4、干細胞，具有自我更新及多向分化的能力，除了集合管起源于輸尿管芽(ureteric bud，UB)外，后腎間充質(zhì)細胞分化形成所有的腎單位和基質(zhì)細胞，在離開胚腎組織仍能發(fā)育成腎固有細胞，這提示胚腎組織具有干細胞微環(huán)境特征。 鑒于以上科學(xué)研究背景，本課題擬在體外，用Transwell小室共培養(yǎng)體系，將骨髓間充質(zhì)干細胞與后腎間充質(zhì)細胞和輸尿管芽分室共培養(yǎng)，利用胚腎組織按內(nèi)在規(guī)律釋放的可溶性因子，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化，觀察誘

5、導(dǎo)后的干細胞在體外誘導(dǎo)輸尿管芽分枝的能力，為以后探討誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化所需的調(diào)控因子及建立單純用誘導(dǎo)因子在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化的方法提供實驗依據(jù)，為腎臟組織工程研究以及將來采用腎干細胞在纖維化的腎組織形成有功能的新腎單位的實驗研究提供充足的無免疫原性的腎臟種子細胞。 方法： 1.用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長特點，四唑鹽

6、比色法(Methylthio tetrazole，MTT)觀察細胞增殖及更新能力，透射電鏡觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，流式細胞儀檢測細胞周期及細胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達，免疫細胞技術(shù)檢測細胞波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、角蛋白(Keratin)、E-鈣粘蛋白(E-cadherins)、CD34等的表達，同時對培養(yǎng)細胞進行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，采用油紅(Oil red)0染色及骨鈣素(

7、osteocalcim，OCN)觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化情況。細胞鑒定后，將其接種于細胞外基質(zhì)膠中進行三維立體(three-dimensional，3D)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞在細胞外基質(zhì)膠中的形態(tài)變化，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞外基質(zhì)膠不同層面的細胞形態(tài)。 2.在解剖顯微鏡下分離孕13.5d(E13.5d)大鼠胚胎，獲取胚胎后腎并去除輸尿管芽，將胚胎后腎間充質(zhì)細胞以組織塊法進行原代培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細胞

8、形態(tài)演變，MTT法觀察細胞增殖及更新能力，透射電鏡和掃描電鏡觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面結(jié)構(gòu)，流式細胞儀檢測細胞周期及細胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達，免疫細胞技術(shù)檢測細胞Vimentin、Fibronectin、Keratin、E-cadherins及CD34的表達，同時進行細胞多向誘導(dǎo)分化(成脂肪細胞、成骨細胞)實驗，分別采用油紅O及OCN染色觀察誘導(dǎo)分化情況。細胞鑒定后，將其接種于細胞外基質(zhì)膠中進行三維立體培養(yǎng)，倒置相差顯

9、微鏡觀察細胞在細胞外基質(zhì)膠中的形態(tài)變化，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞外基質(zhì)膠不同層面的細胞形態(tài)變化。 3.在解剖顯微鏡下分離孕13.5d(E13.5d)大鼠胚胎，獲取胚胎后腎，消化法得到完整的輸尿管芽，將其種植于Transwell小室上室中的細胞外基質(zhì)膠中，后腎間充質(zhì)細胞種植于Transwell小室下室中，二者進行分室共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察輸尿管芽的形態(tài)，免疫細胞技術(shù)對其進行鑒定，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察輸尿管芽的形態(tài)變

10、化。 4.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向腎干細胞分化的體外誘導(dǎo)共培養(yǎng)模型，并分為5組，A：骨髓間充質(zhì)干細胞+后腎間充質(zhì)細胞；B：骨髓間充質(zhì)干細胞+輸尿管芽；C:骨髓間充質(zhì)干細胞+后腎間充質(zhì)細胞+輸尿管芽；D:骨髓間充質(zhì)干細胞；E：空白對照組。用倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)變化，流式細胞儀檢測誘導(dǎo)后細胞周期及細胞表面CD44、CD45、CD90分子的表達，免疫熒光化學(xué)法檢測誘導(dǎo)后細胞的細胞標志物Vimentin、

11、Fibronectin、Keratin、E-cadherins蛋白的表達。誘導(dǎo)后細胞與輸尿管芽共培養(yǎng)，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察誘導(dǎo)后細胞對輸尿管芽的誘導(dǎo)能力。 結(jié)果： 1.大鼠原代BMSCs呈集落樣生長，細胞形態(tài)呈梭形，傳代后細胞生長迅速，形態(tài)比較均一，大部分細胞為成纖維樣或多角形，細胞增殖能力強，具有自我更新能力；透射電鏡結(jié)果顯示細胞核較大，核呈橢圓形或不規(guī)則形，有核突，含有1-2個核仁，胞漿內(nèi)含有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體

12、，其他細胞器較少，胞漿內(nèi)可見分泌小泡，表現(xiàn)出未分化細胞的特征；細胞周期結(jié)果顯示，只有少數(shù)細胞進入增殖活躍期，大部分細胞處于靜止期；流式細胞儀檢測細胞表面分子標志物的結(jié)果顯示，細胞強表達CD44、CD90，不表達CD45；免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示BMSCs明顯表達Vimentin、Fibronectin，不表達Keratin、E-cadherin及CD34； BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以向脂肪細胞、成骨細胞分化，加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基3w

13、后，細胞內(nèi)可見多個折光性強的圓形脂肪滴，油紅O染色呈紅色；在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，可見圓形或卵圓形礦化結(jié)節(jié)，OCN表達陽性。在本實驗中，大鼠BMSCs在由80％I型膠原與20％的微量生長因子基質(zhì)膠組成的細胞外基質(zhì)膠中生長狀態(tài)較好。 2.培養(yǎng)的大鼠MMSCs貼壁生長，梭形，成纖維細胞樣，單個核，核仁大，，形態(tài)均一，細胞增殖能力強，具有自我更新能力；透射電鏡結(jié)果顯示，細胞為長梭形或不規(guī)則形狀，核不規(guī)則，核仁大，胞漿中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)

14、達，可見分泌顆粒；掃描電鏡結(jié)果示，細胞呈梭形或多角形，核仁明顯，細胞連接緊密，表面有微絨毛突起，梭形細胞胞漿向兩極伸出長突起，多角形細胞突起呈樹枝狀，緊緊貼于蓋玻片上；細胞周期結(jié)果顯示，90％以上的細胞處于靜止期，只有少部分細胞處于增殖期；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，幾乎所有細胞都明顯表達CD44、CD90，幾乎所有細胞不表達CD45；免疫細胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示，大鼠MMSCs明顯表達間充質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin、Fibronecti

15、n，不表達Keratin、E-cadherin及CD34；細胞在特定誘導(dǎo)條件下具有多向分化能力，可以向脂肪細胞、成骨細胞分化，誘導(dǎo)分化后的脂肪細胞油紅0染色呈特異性紅色，OCN表達呈陽性，并可形成鈣結(jié)節(jié)。倒置相差顯微鏡下觀察三維立體培養(yǎng)的大鼠MMSCs結(jié)果顯示，不同層面細胞都呈長梭形，培養(yǎng)2-3d可見細胞連接，細胞增殖能力強；激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察可見三維立體培養(yǎng)的細胞明顯表達Vimentin，F(xiàn)ibronectin，不表達Kera

16、tin及E-cadherin。三維立體培養(yǎng)體系中，大鼠MMSCs形狀立體感強，生長狀態(tài)好。 3.倒置相差顯微鏡下觀察E13.5d大鼠的UB呈T形，接種于細胞外基質(zhì)中不斷分枝發(fā)芽。激光掃描共聚焦顯微鏡下，用FITC-DB標記UB，結(jié)果顯示大鼠UB以二叉分枝方式進行分枝、生長，UB頂端的細胞生長迅速，其頸部細胞較頂端(壺腹)部細胞的生長速度慢。隨著生長時間的延長，大鼠UB不斷以二叉分枝方式擴展延伸，逐漸形成樹狀結(jié)構(gòu)。 4.倒

17、置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的大鼠BMSCs，結(jié)果顯示細胞生長密集，界限不清，呈梭形；流式細胞儀檢測誘導(dǎo)后的細胞周期結(jié)果顯示，90％以上的細胞處于靜止期，只有少部分細胞處于增殖期；流式細胞儀檢測誘導(dǎo)后的細胞表面標記物，結(jié)果顯示幾乎所有細胞都明顯表達CD44、CD90，幾乎所有細胞不表達CD45；免疫熒光檢測誘導(dǎo)后的細胞結(jié)果顯示，大鼠后腎間充質(zhì)干細胞明顯表達間充質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin。Fibronectin，不表達上皮細胞標志蛋白Ke

18、ratin及E-cadherin:激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到C組誘導(dǎo)后的細胞對大鼠UB有誘導(dǎo)作用，C組的UB以二叉分枝的方式分枝發(fā)芽。 結(jié)論： 1.我們成功分離培養(yǎng)了大鼠BMSCs和MMSCs，這些細胞具有典型的間充質(zhì)細胞形態(tài)及干細胞表型，具有多向分化能力。 2.我們成功分離、培養(yǎng)、鑒定了大鼠UB。 3.我們建立了大鼠BMSCs在體外向腎干細胞分化模型，實現(xiàn)了BMSCs向腎干細胞的轉(zhuǎn)型。在體外誘導(dǎo)后的大