血管外膜激活促進移植性血管病新內膜形成及發(fā)展的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 本實驗利用袖套管技術將大鼠胸主動脈移植到腹主動脈建立移植性血管病模型,通過在體動物實驗以及體外培養(yǎng)移植血管外膜成纖維細胞,觀察血管外膜細胞表型轉化、增殖、遷移以及多種細胞因子在mRNA和蛋白水平表達的動態(tài)變化,進一步探討血管外膜以及外膜成纖維細胞激活在移植性血管病新內膜形成及發(fā)展中的作用機制。在以上實驗基礎上,本研究進一步探討應用RNA干擾技術特異性地抑制NADPH氧化酶亞基p47phox的表達,從而下調NADPH

2、氧化酶的活性,觀察其對移植血管外膜成纖維細胞增殖和遷移的抑制作用,為移植性血管病以血管外膜成纖維細胞為作用靶點進行基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 本課題分以下三個部分進行研究:
　　 第一部分:移植性血管病大鼠模型的建立
　　 方法:
　　 以Sprague-Dawley大鼠的胸主動脈為供體血管,利用袖套管技術移植到Wistar大鼠腹主動脈作為異系移植實驗組,以SD大鼠對SD大鼠同系移植作為對照組。在血管移

3、植后3,7,14天,取出移植的胸主動脈,進行蘇木素-伊紅染色及Weigert彈力纖維染色,應用Image-Pro Plus5.0計算機圖像分析系統(tǒng)檢測移植血管的內膜和中膜增生情況及內膜/中膜厚度比值。
　　 結果:
　　 手術成功率為90％,移植血管的通暢率達100％。同系移植對照組在各個時間點未出現(xiàn)內膜的明顯增生,而異系移植實驗組在移植后7天出現(xiàn)內膜增生,術后14天內膜厚度顯著增加。對照組和實驗組移植血管中膜均未見明顯

4、增厚。異系移植實驗組內膜/中膜厚度比值在移植后7天開始增高,14天時達到頂峰。
　　 結論:
　　 利用袖套管技術進行SD和Wistar大鼠間的血管移植符合移植性血管病的病理形態(tài)改變,并且操作簡單,費用小,重復性好,可以用于研究移植性血管病的病理機制及干預治療。
　　 第二部分:在體動物實驗研究血管外膜激活在移植性血管病新內膜形成及發(fā)展中的作用
　　 方法:
　　 在血管移植后3,7,14天,取出

5、移植的胸主動脈。用免疫組織化學方法觀察不同時間點血管外膜和內膜波形蛋白,α平滑肌肌動蛋白,T細胞抗原受體CD3,細胞核增殖抗原Ki-67,核因子-κB,MCP-1,細胞間粘附分子-1,血管細胞粘附分子-1,基質金屬蛋白酶-7,TGF-β1,硝基酪氨酸及p47phox等細胞因子蛋白水平表達的動態(tài)變化；用熒光原位雜交技術檢測gp91phox mRNA的表達水平；用熒光實時定量聚合酶鏈反應檢測移植血管外膜MCP-1,IL-1β,TNFα,IC

6、AM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等細胞因子mRNA的表達水平。
　　 結果:
　　 1.免疫組織化學檢測顯示異系移植實驗組和同系移植對照組在血管移植后不同時間點,移植血管外膜及內膜或新內膜的大部分細胞呈現(xiàn)vimentin陽性,中膜幾乎無陽性細胞。異系移植實驗組在術后3天移植血管外膜部分細胞即呈現(xiàn)α-SMA陽性,隨著時間延長α-SMA陽性細胞數(shù)量逐漸增加,術后7天和14天新

7、內膜細胞也開始表達α-SMA,而同系移植對照組血管外膜及內膜細胞幾乎無α-SMA陽性表達:兩組移植血管中膜α-SMA始終呈強陽性表達。
　　 2.異系移植實驗組和同系移植對照組在血管移植后不同時間點移植血管外膜及內膜或新內膜T細胞抗原受體CD3陽性細胞不超過4％,說明增生的細胞主要是外膜成纖維細胞,新內膜形成可能主要與外膜成纖維細胞有關。
　　 3.Ki-67免疫組織化學結果顯示在術后3天異系移植實驗組外膜成纖維細胞開始

8、出現(xiàn)增殖,內膜細胞僅有少量細胞增殖,在術后7天和14天外膜成纖維細胞及內膜細胞均顯著增生；同系移植對照組術后外膜僅出現(xiàn)少量細胞增生。兩組移植血管中膜平滑肌細胞未見增生細胞,中膜厚度也未見明顯改變。
　　 4.免疫組織化學結果顯示在術后3天異系移植實驗組外膜成纖維細胞開始出現(xiàn)NF-κB,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,硝基酪氨酸,p47phox的表達,內膜有少量陽性細胞,在術后7天和14天外膜成纖

9、維細胞及內膜細胞細胞因子表達均顯著增加；同系移植對照組僅NF-κB,MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、硝基酪氨酸在術后外膜出現(xiàn)少量陽性表達細胞,內膜未檢測到陽性細胞。
　　 5.熒光原位雜交技術顯示在術后3天異系移植實驗組外膜成纖維細胞檢測到gp91phox mRNA表達,在術后7天和14天外膜成纖維細胞gp91phox mRNA表達顯著增加,內膜僅有少量gp91phox mRNA表達；同系移植對照組未檢測到gp91pho

10、xmRNA表達。
　　 6.QRT-PCR結果顯示與同系移植對照組相比,異系移植實驗組外膜成纖維細胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phoxmRNA均在術后3天開始表達,術后14天達到頂峰。
　　 結論:
　　 1.在移植性血管病早期新內膜形成前,動脈外膜首先被激活,主要表現(xiàn)為外膜成纖維細胞被激活,開始表達α-SMA,表型轉化為肌成纖

11、維細胞,增殖活性增強,合成釋放多種活性細胞因子,促進移植性血管病新內膜形成及發(fā)展。
　　 2.動脈外膜炎癥是移植性血管病新內膜形成及發(fā)展過程中的早期事件之一,有可能促進血管新內膜的形成。
　　 3.氧化應激貫穿于移植性血管病新內膜形成及發(fā)展整個過程中,可能是血管外膜成纖維細胞被激活的因為之一,并進而促進移植性血管病新內膜形成及發(fā)展。
　　 第三部分:體外培養(yǎng)大鼠血管外膜成纖維細胞研究其在移植性血管病新內膜形成及發(fā)

12、展中的作用
　　 方法:
　　 異系移植實驗組和同系移植對照組在血管移植后14天分別取出移植胸主動脈,將血管外膜剝離,用組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細胞,取3～6代細胞用于實驗。用免疫細胞熒光染色檢測vimentin,α-SMA及結蛋白desmin的表達；用細胞計數(shù)試劑盒及5-溴-2-脫氧尿嘧啶摻入法檢測細胞增殖活性的變化；用流式細胞儀PI染色法檢測細胞周期；用插入式24孔Transwell小室及劃痕實驗檢測細胞的

13、遷移能力；用逆轉錄聚合酶鏈反應檢澳 MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等細胞因子mRNA的表達水平；用Western blot方法檢測MCP-1,ICAM-1,TGF-β1,和p47phox等細胞因子蛋白的表達水平:設計合成靶向NADPH氧化酶亞基p47phox基因的小分子干擾RNA,并進行篩選得到具有高效干擾效率的siRNA,轉染異系移植實驗組體外培

14、養(yǎng)血管外膜成纖維細胞,觀察其對血管外膜成纖維細胞NADPH氧化酶的抑制作用及其對外膜成纖維細胞增殖和遷移活性的抑制作用。
　　 結果:
　　 1.用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的異系移植實驗組和同系移植對照組血管外膜細胞,4～7天后可見細胞從組織塊邊緣游出,貼壁生長,10～14天后達到90％細胞融合。異系移植實驗組血管外膜細胞呈現(xiàn)vimentin(+)、desmin(-)、約90％的細胞呈現(xiàn)α-SMA(+)；同系移植對照組血管外膜細

15、胞呈現(xiàn)vimentin(+)、desmin(-)、90％以上的細胞呈現(xiàn)α-SMA(-)。
　　 2.血清濃度為1％時,異系移植實驗組和同系移植對照組培養(yǎng)血管外膜成纖維細胞細胞增殖活性無顯著性差異,血清濃度為5％和10％時,異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞增殖活性顯著高于同系移植對照組；血清濃度為10％時,BrdU摻入法也得到相同結果。流式細胞儀PI染色法顯示異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞S期及G2/M期所占百分比顯著高于同系移

16、植對照組。
　　 3.插入式24孔Transwell小室實驗顯示異系移植實驗組遷移到Transwell小室PET膜下表面的成纖維細胞數(shù)明顯高于同系移植對照組；劃痕實驗也顯示異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞的愈合速率要明顯高于同系移植對照組。
　　 4.RT-PCR檢測顯示異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox

17、等細胞因子mRNA的表達水平均明顯高于同系移植對照組。
　　 5.Western blot方法檢測顯示異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞MCP-1,ICAM-1,TGF-β1和p47phox等細胞因子蛋白的表達水平也明顯高于同系移植對照組。
　　 6.p47phox-siRNA-2＃轉染異系移植實驗組體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細胞48小時后可有效抑制p47phox基因在mRNA水平的表達,從而抑制NADPH氧化酶,并可以顯著降

18、低成纖維細胞的增殖和遷移活性。
　　 結論:
　　 1.約90％的異系移植實驗組血管外膜細胞轉化為肌成纖維細胞,而同系移植對照組90％以上的細胞為成纖維細胞。
　　 2.異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞的增殖及遷移能力明顯高于同系移植對照組。
　　 3.異系移植實驗組血管外膜成纖維細胞合成和釋放多種活性細胞因子的能力明顯高于同系移植對照組。
　　 4.氧化應激參與血管外膜成纖維細胞的激活,激活的成