血藍蛋白在雜色鮑各組織中的表達與分布規(guī)律研究.pdf

1、 學 校 代 碼 學 校 代 碼 ： 1 0 2 6 4 1 0 2 6 4 研究生學號： M1110104176上 海 海 洋 大 學 碩 士 學 位 論 文 碩 士 學 位 論 文 題 目： 目： 血藍蛋白在雜色鮑各組織中的表達與分布規(guī) 血藍蛋白在雜色鮑各組織中的表達與分布規(guī)律研究 律研究 英文題目： 英文題目： Studies on the expressing and distributing charact

2、eristic of Hemocyanin in different tissues of Haliotis diversicolor 專 業(yè)： 業(yè)： 臨床獸醫(yī)學 研究方向： 研究方向： 漁業(yè)生物病害 姓 名： 名： 張晗 指導教師： 指導教師： 王江勇 研究員 上海海洋大學，上海，200090 中國水產(chǎn)科學院南海水產(chǎn)研究所，廣州 ，510300 上海海洋大學碩士學位論文 I 血藍蛋白在雜色鮑各組織中的表達與分布規(guī)律

3、研究 摘 要 血藍蛋白（hemocyanin）是節(jié)肢、軟體動物中的一種多功能蛋白，具有氧氣運輸、免疫防御、蛋白質(zhì)儲存、金屬離子轉運、蛻皮激素載體、滲透壓調(diào)節(jié)和表皮固化等多種功能。 血藍蛋白在血淋巴中的含量非常豐富， 然而作為一種重要的多功能蛋白， 對其成熟的蛋白分子在動物各組織中的分布情況了解較少， 其組織表達的具體部位尚不明確。 本研究通過免疫組化技術、 熒光定量 PCR 技術 （qPCR）和熒光原位雜交技術（FISH）對血藍蛋白在

4、雜色鮑（Haliotis diversicolor）各組織中的表達與分布規(guī)律進行了研究， 對深入理解血藍蛋白分子功能的多樣性及軟體動物血藍蛋白組織表達規(guī)律的生理適應性具有重要意義。 首先通過 Western Blotting 方法對雜色鮑血藍蛋白多克隆抗體的濃度進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)上樣量 10 μg 時，一抗 1:12000 的稀釋度所見清晰條帶最多；在一抗1:12000 的稀釋度時，不同上樣量（1 μg、2 μg、4 μg 和 8 μg）

5、Western 結果的雜交條帶都比較清晰，故 1:12000 的抗體稀釋度最適合本研究。進一步的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)， 在成鮑和幼鮑各組織中均發(fā)現(xiàn)了血藍蛋白陽性信號， 但不同組織中信號強弱不同，在成鮑與幼鮑中血藍蛋白的組織分布一致，均為肝胰臟、外套膜和鰓中大量分布，而消化道和腹足中的分布相對較少。 其次，采用 qPCR 技術對編碼血藍蛋白的兩個亞型基因（Hc1、Hc2）在各組織中的表達水平進行了研究。 首先， 根據(jù)課題組克隆得到的雜色鮑血藍

6、蛋白全基因序列對兩個基因分別設計了兩對特異引物，利用腹足、鰓和鰓下腺組織的cDNA 作為模板，對引物的特異性進行檢測，發(fā)現(xiàn)引物 Hc1F2/Hc1R2 和Hc2F1/Hc2R1 的特異性良好。qPCR 檢測結果表明，Hc1 與 Hc2 在成鮑腹足、外套膜、上足、鰓下腺、鰓、肝胰臟和血細胞中均有表達，并且兩基因的組織表達豐度一致，均在肝胰臟、外套膜、鰓下腺和鰓中較高，而血細胞、腹足和上足中較低。兩個基因相比較發(fā)現(xiàn)，各組織中 Hc1 表達量