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文檔簡介
1、目的以AdEasy腺病毒表達系統(tǒng)制備攜帶Cbfa1基因的高滴度腺病毒,感染小鼠成肌細胞C2C12,利用外源性基因編碼的生長因子誘導其表達成骨細胞表型。再將感染的C2C12與高分子生物材料chronOS支架相復合,在體外構建組織工程化骨,移植修復小鼠股骨骨缺損,觀察該方法的可行性和有效性,以期找到一種較好的修復骨缺損的方法。 方法(1)將小鼠Cbfa1基因cDNA克隆到穿梭載體形成轉移質粒pAdTrack-CMV-Cbfa1,經(jīng)P
2、meI酶切線性化后與骨架質粒感受態(tài)細胞AdEasier-1Cells經(jīng)電穿孔法同源重組得到腺病毒質粒pAdCbfa1并酶切鑒定,PacI酶切線性化后感染293細胞包裝后獲得復制缺陷型重組腺病毒AdCbfa1。(2)以復制缺陷重組腺病毒介導小鼠Cbfa1基因感染C2C12后,以MTT法及流式細胞儀觀察感染對細胞增殖活力及細胞周期的影響;用RT-PCR法、免疫組化染色以及Westernblot證實轉基因C2C12的Cbfa1蛋白和Ⅰ型膠原的
3、表達情況;通過改良Gomori鈣鈷法及ALP檢測試劑盒檢測兩組細胞的ALP活性;通過放免分析試劑盒檢測兩組細胞的骨鈣素(osteocalcin,OCN)含量。(3)制備孔徑為150~300μm,孔隙率為90%的chronOS與腺病毒感染后的C2C12共培養(yǎng),電鏡觀察了解細胞在chronOS上粘附、生長和合成分泌骨基質成分的情況;并在體內構建組織工程化骨,通過組織學觀察了解組織工程化骨形成情況。(4)制備小鼠股骨骨缺損模型,以Cbfa1基
4、因感染的C2C12-chronOS復合物移植修復缺損區(qū),同時對側單純人工骨chronOS修復組進行對比。術后分別采用大體觀察、組織學觀察等方法對骨缺損修復情況進行對比觀察。 結果(1)酶切鑒定表明Cbfa1基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭質粒且腺病毒重組質粒pAdCbfa1構建成功;經(jīng)293細胞包裝3d后可觀察到綠色熒光蛋白表達(GFP),氯化銫梯度離心法最終獲得約3×109efu/L滴度的重組病毒。(2)腺病毒感染后C
5、2C12形態(tài)特征、細胞增殖情況及細胞周期無顯著變化,實驗證實用Ad-Cbfa1感染的C2C12具有成骨細胞的結構特征和生物學特性。感染后的C2C12的堿性磷酸酶及骨鈣素含量均較未感染組有顯著增高,差異均有顯著性意義(p<0.05);Ⅰ型膠原表達的半定量分析顯示轉基因組為1.32±0.16,對照組為3.65±0.31,差異均有顯著性意義(p<0.01)。(3)制備得到的chronOS為疏松多孔的網(wǎng)格樣結構,具有一定的韌性和強度。將腺病毒感
6、染的成肌細胞接種于修剪成一定形狀的chronOS上,經(jīng)電鏡觀察可見細胞貼附于材料表面和孔隙內并增殖。異位成骨實驗證實該復合材料可在4至6周時觀察到有新骨形成。(4)檢測結果分析證實,感染的C2C12修復骨缺損的成骨速度及成骨量均優(yōu)于單純chronOS組。結論(1)AdEasy系統(tǒng)是一種方便高效的腺病毒表達系統(tǒng),利用其可以使得目的基因得到有效表達。(2)chronOS是一種良好的骨組織工程的載體材料,有利于種子細胞的粘附生長,并能在體外構
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