索拉非尼聯(lián)合肝素-達肝素對腫瘤抑制作用的研究.pdf

1、我國是肝癌大國，全球每年新發(fā)肝癌病例有50％來自中國。許多患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，或治療后發(fā)生轉移，此時，手術、放療、介入都無能為力。本研究選擇分別針對腫瘤增殖本身和腫瘤微環(huán)境刺激因素的兩種作用機制不同的藥物，索拉非尼和肝素/達肝素，設計了一系列實驗，觀察其對肝癌細胞增殖、侵襲性和血管生成的影響，以驗證聯(lián)合用藥能夠增加療效的假設。 研究材料與方法： 主要試劑及實驗細胞 索拉非尼(多吉美，甲苯磺酸索拉非尼片)用10％DMSO

2、溶解稀釋，然后以DMEM高糖培養(yǎng)基(H-DMEM)溶解至所需濃度。肝素，低分子量肝素達肝素(法安明，達肝素鈉注射液)以H—DMEM溶解至所需濃度。選擇高侵襲性肝細胞癌細胞系HCCLM6作為實驗用細胞。 MTT實驗 對數(shù)生長期的肝癌細胞系HCCLM6，胰酶消化后接種于96孔板，5×103個/孔，分別與不同濃度的索拉非尼、肝素、達肝素共同孵育72h(單藥組)，或不同濃度肝素/達肝素孵育24h后，加入一定濃度索拉非尼繼續(xù)孵育48h(聯(lián)

3、合用藥組)，然后加入MTT繼續(xù)孵育4h，DMSO溶解，酶標儀測定.490nm的OD值，與空白對照相比，計算細胞存活率。 流式細胞儀測定細胞周期及凋亡率的變化肝癌細胞HCCLM6每孔1×104個接種于6孔板，分別加入索拉非尼(4μmol/L)、或肝素/達肝素(10IU/ml)、或兩藥聯(lián)合，24h后收集細胞，PI染色后以流式細胞儀分析細胞周期；或同樣加藥方法，處理后AnnexinV-FITC及PI雙染，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

4、 免疫印跡實驗檢測p-ERK1/2及ERK1/2蛋白表達收集藥物作用后的細胞，提取蛋白進行SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉移至PVDF膜，依次加入一抗及二抗，與發(fā)光試劑溫浴后曝光、顯影和定影，進行結果分析。 細胞黏附實驗96孔培養(yǎng)板上鋪設Matrigel，接種HCCLM6細胞2×103個/孔，分別加入索拉非尼、肝素、達肝素及聯(lián)合藥物，1h后以蘇木素一伊紅染色基質膜黏附細胞數(shù)，與空白對照相比，計算細胞黏附率。 細胞

5、侵襲實驗在24孔Transwell上室鋪設Matrigel，使之在微孔濾膜上凝固為基底膜結構，向上室接種HCCLM61×106個/孔，分別加入預設藥物，12h后Giemsa染色后計數(shù)穿膜細胞數(shù)，與空白對照相比，計算細胞侵襲率。 雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)實驗8日齡胚蛋，隨機分組，每組10只分組加入索拉非尼、肝素、達肝素及聯(lián)合藥物，72h后計數(shù)CAM的血管數(shù)量。 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行單方差分析(One

6、wayANOVA)，多重比較采用LSD方法，MTT實驗不同濃度單藥組與對照組比較使用Dunnett方法，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，文中的數(shù)據(jù)表述如未加說明均采用-x±SD格式。 結果： MTT實驗鏡下觀察，對照組細胞個體大，排列緊密，形狀不規(guī)則；索拉非尼組細胞密度依藥物濃度遞減，肝素/達肝素組細胞突起減少，細胞間距增大。MTT染色結果顯示各濃度索拉非尼細胞存活率較對照組細胞存活率顯著降低

7、(均P<0.05)，與肝素/達肝素聯(lián)用，細胞存活較各單藥組進一步降低(均P=0.000)，達肝素對索拉非尼的增效作用大于相同濃度的肝素組(均P<0.05)。 細胞周期應用流式細胞儀分析細胞周期，各用藥方式對細胞G1期(F=1.619，P=0.229)和G2期(F=1.326，P=0.318)影響差異不顯著，對細胞S期的影響存在顯著差異(F=3.508，P=0.035)，索拉非尼及達肝素組較對照組S期細胞升高均有統(tǒng)計學意義(均P<

8、0.05)，肝素/達肝素對索拉非尼沒有顯著影響(均P>0.05)。 細胞凋亡率流式細胞儀測細胞凋亡，早期凋亡率：各用藥方式對細胞早期凋亡率的影響存在顯著差異(F=13.916，p=0.000)，單藥索拉非尼、肝素、達肝素較對照組顯著增高(均P<0.05)，肝素及達肝素單藥之間沒有顯著差異(P=0.427)，聯(lián)合組較單藥組顯著增高(均P<0.05)，肝素聯(lián)合索拉非尼與達肝素聯(lián)合索拉非尼之間沒有顯著差異(P=0.587)；晚期凋亡率

9、：各用藥方式對細胞晚期凋亡率的影響存在顯著差異(F=373.217，P=0.000)，與對照組相比較，索拉非尼組晚期凋亡率顯著增高(P=0.000)，肝素/達肝素晚期凋亡率與對照組沒有顯著差異(均P>0.05)；聯(lián)合用藥時，肝素/達肝素對索拉非尼沒有顯著增效作用(均P>0.05)。 免疫印跡實驗ERK1/2的表達各組變化不明顯(F=1.302，P=0.326)，而p-ERK的表達在各組間差異顯著(F=47.011，p=0.000

10、)，用藥組均較對照組降低(均P<0.05)，聯(lián)合用藥組較各個單藥組又有一定程度的降低(均P<0.05)，肝素組與達肝素組p-ERK的表達差異不顯著(P<0.05) 黏附實驗各用藥方式對細胞黏附率的影響存在顯著差異(F=149.871，P=0.000)，與對照組相比較，肝素/達肝素組腫瘤細胞與基質間黏附率顯著下降(均P=0.000)，肝素與達肝素之間沒有顯著差異(P=0.696)，而索拉非尼對細胞的黏附作用的影響沒有統(tǒng)計學差異(P

11、=0.097)；聯(lián)合用藥組，索拉非尼無論對肝素還是達肝素都沒有顯著的增效作用(均P>0.05)。 侵襲實驗各用藥方式對細胞侵襲率的影響存在顯著差異(F=78.773，p=0.000)，較對照組，索拉非尼、肝素/達肝素顯著抑制了細胞的侵襲能力(均P=0.000)，肝素及達肝素之間沒有顯著差異(P=0.336)；聯(lián)合用藥時，索拉非尼顯著增強了肝素及達肝素抑制細胞侵襲的作用(均P<0.05)，索拉非尼聯(lián)合肝素或達肝素之間沒有顯著差異(

12、P=0.391)。 CAM實驗固定前觀察各組CAM血管，與對照組比較，索拉非尼組血管減少，可見大血管繞道行走和明顯的迂曲變形；肝素/達肝素組大血管增多，小血管明顯減少，血管變形少見；聯(lián)合用藥組血管進一步減少，可見少量迂曲變形的血管。分析各組血管生成數(shù)量的差異，發(fā)現(xiàn)各用藥方式對血管數(shù)量的影響存在顯著差異(F=206.659，p=0.000)，添加藥物后各實驗組的血管生成較對照組均顯著減少(均P=0.000)；肝素組、達肝素組間無統(tǒng)

13、計學差異(P=0.447);聯(lián)合用藥各組較各單藥各組血管生成顯著減少(均P<0.05)，(索拉非尼+肝素)組與(索拉非尼+達肝素)組間的差異不顯著(P=0.633)。 討論: 隨著診療手段的進步，肝癌患者的生存期大大延長，伴隨而來的是遠處轉移或治療后復發(fā)率的增加。肝癌的轉移越來越引起研究者們的重視。腫瘤的生長和播散設計一系列的惡性生物學行為，如無限增殖、侵襲性、遠處生長、結構紊亂、惡性血管增生等。在以往的研究中，我們把注

14、意力幾乎全部集中在腫瘤細胞本身。腫瘤微環(huán)境，即腫瘤細胞所處的環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等各方面起著重要的作用，腫瘤細胞之間以及與微環(huán)境各組分之間通過各種細胞因子及受體進行交流。肝癌細胞的進展同樣依靠與微環(huán)境之間的交流。針對這些相互作用因子，產(chǎn)生了一系列的分子靶向藥物，有的直接針對腫瘤細胞上特異性受體，如索拉非尼、吉非替尼，有的則針對微環(huán)境中的腫瘤相關因子，如貝伐單抗、西妥昔單抗、肝素等。 小分子多靶點激酶抑制劑索拉非尼可以阻

15、斷細胞生長的重要通路Raf/MEK/ERK的多個酪氨酸激酶受體，并抑制VEGFR2、PDGFR、FLT3、Ret、和c-Kit等血管生成刺激因子。2007年2月12日，納入602例患者的III期臨床雙盲隨機對照研究SHARP試驗顯示，與安慰劑相比，索拉非尼可顯著延長晚期肝細胞癌或原發(fā)性肝癌患者的總生存期。 肝素/低分子量肝素通過與腫瘤微環(huán)境中生長因子、阻滯因子、蛋白水解酶和基質(ECM)蛋白結合，從而發(fā)揮抗腫瘤細胞生長、轉移、侵

16、襲以及抑制血管生成的作用。腫瘤細胞分泌過量的類肝素酶降解ECM的重要組分硫酸類肝素蛋白聚糖，促成了腫瘤的播散和血管生成，肝素等類肝素酶抑制劑可以抑制這一作用。在一些臨床研究中發(fā)現(xiàn)，使用肝素或低分子量肝素對腫瘤患者有延長生存期的作用。目前認為這可能與直接抗腫瘤、調節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤微環(huán)境中的各種蛋白和抗血管形成等因素有關。 一個主攻腫瘤細胞，一個阻抑腫瘤微環(huán)境蛋白，將這樣兩種抗腫瘤藥物聯(lián)用，理論上可以相互輔助，全面抑制腫瘤。我們

17、通過實驗驗證了這一假設，索拉非尼與肝素/達肝素聯(lián)用較單藥更有效地抑制了腫瘤細胞的增殖和血管增殖，在對黏附力和侵襲力等腫瘤轉移相關指標方面也表現(xiàn)出了一定的聯(lián)合作用，而在肝素、達肝素二者之間，無論單用或與索拉非尼聯(lián)用，效果差別均不顯著。我們可以在進一步的動物實驗中明確兩藥聯(lián)用的整體水平效果及副作用，為臨床應用打下基礎。同時，由于肝素/達肝素目前臨床上只是用于腫瘤患者的抗血栓治療，還未正式作為一種抗腫瘤藥物使用，嘗試將其與療效明確的抗腫瘤藥物