血紅素氧合酶-1基因調(diào)控對非相當于精性脂肪性肝炎-肝纖維化防治作用的研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是具有與酒精性脂肪性肝病相同病理改變而無過量飲酒史的臨床病理綜合癥。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis， NASH)、非酒精性脂肪性肝纖維化和NASH相關(guān)肝硬化，其中非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化是該病進展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段。迄今，關(guān)于該病發(fā)生及

2、進展的機制尚不十分清楚，亦缺乏有效的治療措施。
　　 血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是一種抗氧化酶，主要功能是催化血紅素產(chǎn)生等摩爾的膽綠素/膽紅素、一氧化碳和游離鐵，具有抗氧化、抗炎、抑制細胞增生、改善微循環(huán)等生物學作用，但其在非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化中的作用及作用機制尚不清楚。
　　 本課題采用高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏(high fat， methionine-choline def

3、icient diet， MCD)飲食建立非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化動物模型，觀察HO-1表達與肝脂肪變、炎癥及纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并探討HO-1靶向調(diào)控的治療作用及作用機制，為該病治療策略的選擇及藥物的開發(fā)提供科學依據(jù)。
　　 第一部分、非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化動物模型的建立及HO-1表達的研究
　　 目的：探討HO-1在非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化發(fā)病過程中的表達、作用及作用機制。
　　 方法：采用M

4、CD飲食喂養(yǎng)健康雄性C57BL/6J小鼠4周、8周，分別建立非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纖維化模型，以膽堿-蛋氨酸充足飲食設立對照組。酶法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase， ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase， AST)水平；HE、蘇丹Ⅳ和Masson染色觀察肝脂肪變、炎癥活動和纖維化程度，肝脂肪變、炎癥及纖維化程度的評估依據(jù)2010年中

5、華醫(yī)學會脂肪肝學組《非酒精性脂肪性肝病診療指南》及美國NASH臨床研究協(xié)會病理工作組2005年制定的NAFLD組織學評分(NAFLD activity score， NAS)系統(tǒng)；以實時定量PCR、Western blot和免疫組織化學染色檢測HO-1 mRNA及蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.實驗小鼠血清ALT、AST水平：
　　 MCD飲食喂養(yǎng)4周及8周后，模型組小鼠的血清ALT(267.03±31.50

6、U/L、695.87±73.96U/L)和AST(517.43±20.84U/L、986.93±23.69U/L)水平較對照組ALT（31.43±4.76U/L、32.43±13.54U/L）和AST（34.73±6.16U/L、33.20±14.00U/L）水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.001。
　　 2.實驗小鼠肝臟解剖學及組織病理學變化：
　　 2.1 大體觀察
　　 對照組小鼠肝臟大小正常、被膜

7、光滑，為暗紅色，明亮有光澤；模型組小鼠4周時即出現(xiàn)肝臟體積減小，顏色變黃，有油膩感；8周時肝臟減小明顯、黃色油膩感更加明顯、無光澤，邊緣圓鈍，與周圍組織有粘連。
　　 2.2 光鏡下觀察
　　 HE及Masson染色：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常；MCD飲食4周，肝細胞彌漫性水樣變，伴有大泡性為主的肝細胞脂肪變，以腺泡3帶為著，肝竇間隙變窄，小葉內(nèi)可見點狀或灶狀肝細胞壞死，伴有淋巴細胞和少量中性粒細胞浸潤（NAS評分6～7S

8、1）；MCD飲食8周，小鼠肝脂肪變、肝細胞壞死、炎性細胞浸潤加重，竇周細胞增生活躍，匯管區(qū)擴大，纖維組織增生，可見纖維間隔形成(NAS評分7～8S1～2)。蘇丹Ⅳ染色：對照組肝細胞胞漿偶見脂肪小滴；模型組，MCD飲食4周肝細胞脂肪變明顯，胞漿充滿鮮紅色脂滴，8周較4周肝細胞脂肪變加重。
　　 3.實驗小鼠肝組織HO-1 mRNA及蛋白表達及其在肝損傷中的作用：
　　 3.1 HO-1 mRNA表達實時定量PCR檢測。實驗

9、小鼠喂養(yǎng)4周和8周，對照組肝組織HO-1 mRNA少量表達（0.86±0.12和0.79±0.20）：模型組4周和8周HO-1 mRNA表達（5.49±1.26和4.66±0.67）均較對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。
　　 3.2 HO-1蛋白表達Western blot檢測。實驗小鼠肝組織HO-1蛋白表達與mRNA表達呈一致趨勢，模型組4周和8周（0.66±0.05、0.53±0.08）較對照組（0.22±

10、0.03、0.26±0.09）顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.01；肝組織切片免疫組織化學染色顯示，造模4周和8周，對照組肝組織中偶見HO-1在Kupffer細胞中表達，陽性細胞百分比分別為：0.09±0.01和0.04±0.00；模型組為1.13±0.18和0.91±0.15，主要表達在Kupffer細胞、肝星狀細胞和肝細胞的胞漿中，兩組間差異顯著，P＜0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1.高脂、膽堿-蛋氨酸缺乏飲

11、食可誘導與人類非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化比擬性良好的動物模型，為發(fā)病機制和治療藥物的研究提供了良好的實驗模型。
　　 2.非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化組織中HO-1 mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)，可能為一種對氧化性肝損傷的反應性保護作用，表明HO-1參與非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化的發(fā)病及進展。
　　 第二部分、HO-1基因調(diào)控對非酒精性脂肪性肝炎中肝細胞凋亡的影響
　　 目的：探討HO-1對非酒精性脂肪性肝炎發(fā)

12、病及進展中肝細胞凋亡的影響及機制。
　　 方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠4周，建立NASH模型。分別應用HO-1抑制劑鋅原卟啉(ZnPP-IX)、激動劑血晶素(hemin)及/或腺病毒載體HO-1基因?qū)?Ad-HO-1)進行干預實驗，設立對照組及空載體Ad-GFP導入組。酶法測定血清ALT和AST水平；光鏡下觀察肝脂肪變及炎癥程度：硫代巴比妥酸法測定肝組織丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量；脫

13、氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotide transferase mediated dUTP nick end labeling method, TUNEL)檢測肝細胞凋亡的形態(tài)特征和分布，并計算細胞凋亡指數(shù)；免疫組織化學染色、實時定量PCR和Western blot法檢測HO-1的分布及表達；實時定量PCR和Western blot法檢測凋亡相關(guān)因子mRNA及蛋白的表達。
　　

14、 結(jié)果：
　　 1.實驗小鼠血清ALT及AST水平：
　　 對照組、模型組及Ad-GFP導入組ALT和AST依次為：31.43±4.76U/L和34.73±6.16U/L、267.03±31.50U/L和268.27±30.44U/L、517.43±20.84U/L和509.73±16.57U/L，模型組和Ad-GFP導入組顯著高于對照組；HO-1激動劑血晶素組為109.16±16.49U/L和235.38±14.37

15、U/L，顯著低于模型組；HO-1抑制劑鋅原卟啉組ALT和AST為499.74±14.09U/L和75.12±63.89U/L，顯著高于模型組：HO-1腺病毒Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合組血清ALT(110.12±9.12U/L、103.24±6.07U/L)和AST（211.34±19.86U/L、205.86±13.37U/L）均較Ad-GFP導入組顯著降低；血晶素組、Ad-HO-1導入組及血晶素與Ad-HO-1聯(lián)

16、合應用組三者間血清ALT、AST水平無明顯差異。
　　 2.實驗小鼠組織病理學變化：
　　 肝組織切片HE染色顯示，模型組、Ad-GFP導入組可見中、重度脂肪變及明顯的炎性細胞浸潤（NAS評分6～7S1），肝損傷表現(xiàn)同第一部分。血晶素組、Ad-HO-1導入組、血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組小鼠肝損傷較模型組明顯減輕，肝細胞輕度水樣變，脂肪變輕微，未見明顯肝細胞壞死及炎性細胞浸潤(NAS評分2～3S0)，血晶素和Ad-H

17、O-1聯(lián)合應用組未見明顯的協(xié)同作用；鋅原卟啉干預組較MCD模型組肝細胞重度脂肪變性、炎細胞浸潤更加明顯(NAS評分7～8S1～2)。
　　 3.實驗小鼠肝細胞的凋亡情況：
　　 TUNEL分析結(jié)果顯示，對照組肝細胞凋亡偶見(0.43±0.25％)；與對照組相比，MCD模型組及Ad-GFP導入組TUNEL陽性細胞數(shù)（3.59±1.02％、4.17±1.04％）明顯增多；與模型組比較，血晶素組TUNEL陽性細胞數(shù)（1.63±

18、0.78％）明顯減少，而鋅原卟啉組TUNEL陽性細胞數(shù)（6.38±0.80％）顯著增多，與肝組織損傷程度相一致；Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組TUNEL陽性細胞數(shù)(1.53±0.45％、1.33±0.53％)較Ad-GFP導入組明顯減少，但血晶素組、Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間TUNEL陽性細胞數(shù)無明顯差異。
　　 4.實驗小鼠肝組織中MDA含量的變化：
　　 MC

19、D模型組及Ad-GFP導入組肝組織MDA含量（5.09±1.01nmol/mg、4.95±0.75nmol/mg）較對照組（1.68±0.32nmol/mg）明顯升高；與模型組比較，血晶素組肝組織MDA含量（3.50±0.67nmol/mg）明顯降低，而鋅原卟啉組MDA含量（6.44±0.65nmol/mg）升高顯著；Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組MDA含量（3.69±0.78nmol/mg、3.13±0.66n

20、mol/mg）較Ad-GFP導入組明顯降低，但血晶素組、Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間MDA含量無明顯差異。
　　 5.實驗小鼠肝組織中HO-1表達情況：
　　 實時定量PCR和Western blot法檢測顯示HO-1 mRNA及蛋白的表達呈一致趨勢，MCD模型組及Ad-GFP導入組顯著高于對照組，P＜0.01，P＜0.001；血晶素組、Ad-HO-1導入組及血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用

21、組顯著高于模型組，P＜0.01，P＜0.001;鋅原卟啉組HO-1表達明顯減少。肝組織切片免疫組化染色結(jié)果顯示，HO-1表達與上述結(jié)果呈一致趨勢，主要表達于Kupffer細胞、肝星狀細胞和肝細胞漿內(nèi)。
　　 6.HO-1基因調(diào)控對實驗小鼠肝組織CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達的影響：
　　 與對照組比較，MCD模型組和Ad-GFP導

22、入組肝組織CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表達明顯升高；與模型組對比，血晶素組肝組織CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表達顯著下降，而鋅原卟啉組CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表達進一步升高；與Ad-GFP導入組比較，A

23、d-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c和Bax mRNA及蛋白表達顯著下降；Bcl-2 mRNA及蛋白在各組小鼠肝組織中的表達與上述因子的表達趨勢相反。但血晶素組、Ad-HO-1導入組及血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間CYP2E1、Fas、FasL、caspase-3、caspase-9、Cyt-c、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表

24、達無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.在MCD飲食誘導的NASH模型中，氧化應激可能是肝細胞發(fā)生凋亡的始動因素。
　　 2.血晶素和Ad-HO-1基因?qū)肷险{(diào)HO-1表達，阻止或減輕氧化應激導致的肝損傷。
　　 3.HO-1基因表達上調(diào)可通過抑制氧化應激反應和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達阻止肝細胞凋亡的發(fā)生，從而減緩或阻止非酒精性脂肪性肝炎的進展。
　　 第三部分、HO-1基因調(diào)控對非酒精性脂肪性肝纖

25、維化小鼠纖維化相關(guān)因子表達的影響
　　 目的：探討HO-1基因調(diào)控在非酒精性脂肪性肝纖維化進展中的作用及其機制。
　　 方法：采用MCD飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，實驗分組及干預方式同第二部分。酶法測定小鼠血清ALT和AST水平；光鏡下觀察肝脂肪變、炎癥活動及纖維化程度；羥脯氨酸分析法測定肝臟膠原含量；硫代巴比妥酸法測定肝組織MDA含量；RT-PCR和實時定量PCR測定腫瘤壞死因子α

26、(tumor necrosis factor-alpha， TNF-α)、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）和細胞信號傳導抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling-1， SOCS-1）mRNA表達；實時定量PCR和Western blot法檢測HO-1、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin， a-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transformi

27、ng growth factor beta1， TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase2)、基質(zhì)金屬蛋白-9（matrix metallopeptidase-9）mRNA和蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.實驗小鼠血清ALT及AST水平：
　　 對照組、模型組和Ad-GFP導入組ALT和AST依次為：32.43±13.54U/L和33.20±24.00U/L、695.

28、87±73.96U/L和986.93±23.70U/L、643.93±45.01U/L和918.90±127.74U/L，模型組和Ad-GFP導入組顯著高于對照組；HO-1激動劑血晶素組ALT和AST為234.28±35.36U/L和308.80±29.20U/L，顯著低于模型組；HO-1抑制劑鋅原卟啉組ALT和AST為983.50±28.72U/L和1122.52±64.54U/L，顯著高于模型組；與Ad-GFP導入組相比，HO-1腺

29、病毒Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組血清ALT(229.96±38.86U/L、219.80±26.06U/L)、AST(291.00±20.53U/L、267.07±36.42U/L)均較Ad-GFP導入組顯著降低；血晶素組、Ad-HO-1導入組及血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間血清ALT、AST水平無明顯差異。
　　 2.實驗小鼠肝組織病理學變化：
　　 肝組織切片HE及Masson染色顯

30、示，模型組、Ad-GFP導入組肝細胞脂變、點灶狀壞死明顯，竇周細胞增生活躍，可見炎細胞浸潤，匯管區(qū)擴大，纖維組織增生，纖維間隔形成(NAS評分7～8S1～2)；血晶素組、Ad-HO-1導入組、血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組小鼠肝組織病變較模型組明顯減輕，少數(shù)肝細胞脂肪變，個別氣球樣變，偶見小葉內(nèi)點、灶狀壞死，輕度纖維組織增生，匯管區(qū)擴大不明顯(NAS評分3～4S0～1)，血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組未見明顯的協(xié)同作用；鋅原卟啉組肝

31、細胞重度脂肪變性，炎細胞浸潤、竇周纖維化明顯(NAS評分7～8S2～3)。
　　 3.HO-1調(diào)控對實驗小鼠肝組織中羥脯氨酸含量的影響：
　　 造模8周，MCD模型組和Ad-GFP導入組肝組織羥脯氨酸含量(196.67±21.93μg/mg、316.67±44.01μg/mg）均顯著高于對照組（196.67±21.93μg/mg）；與模型組比較，血晶素組肝組織羥脯氨酸含量（263.00±14.73μg/mg）明顯降低，而

32、鋅原卟啉組肝組織羥脯氨酸含量（446.00±24.42μg/mg）顯著增高；與Ad-GFP導入組對比，Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組肝組織羥脯氨酸含量亦明顯降低（271.67±13.32μg/mg、258.67±20.21μg/mg）；血晶素組、Ad-HO-1導入組及血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間肝組織羥脯氨酸含量無明顯差異。
　　 4.HO-1調(diào)控對實驗小鼠肝組織中MDA含量的影響：
　　

33、 造模8周，與對照組（1.49±0.40nmol/mg）比較，MCD模型組及Ad-GFP導入組肝組織MDA含量（4.81±0.98nmol/mg、4.63±0.92nmol/mg）明顯升高；與模型組相比，血晶素組肝組織MDA含量（3.57±0.63nmol/mg）明顯降低，而鋅原卟啉組MDA含量（6.29±0.69nmol/mg）升高顯著；與Ad-GFP導入組相比，Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組MDA含量（3.

34、43±0.49nmol/mg、3.00±0.40nmol/mg）亦明顯降低，但血晶素組、Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間MDA含量無明顯差異。
　　 5.實驗小鼠肝組織HO-1 mRNA及蛋白的表達：
　　 各組實驗小鼠HO-1表達趨勢同第二部分。
　　 6.HO-1調(diào)控對實驗小鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達的影響：
　　 MCD模型組及Ad-

35、GFP導入組肝組織TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達較對照組明顯升高；與模型組比較，血晶素組肝組織TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達顯著下降，而鋅原卟啉組TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達進一步升高；與Ad-GFP導入組比較，Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達顯著下降，而血晶素組、Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合

36、應用組三者間TNF-α、IL-6和SOCS-1 mRNA表達無明顯差異。
　　 7.HO-1調(diào)控對實驗小鼠肝組織纖維化相關(guān)因子α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA及蛋白表達的影響：
　　 MCD模型組及Ad-GFP導入組肝組織α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達較對照組明顯升高；與模型組比較，血晶素組肝組織α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達顯著下

37、降，而鋅原卟啉組α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達進一步升高；與Ad-GFP導入組對比，Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達顯著下降，而血晶素組、Ad-HO-1導入組和血晶素與Ad-HO-1聯(lián)合應用組三者間α-SMA、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA表達無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.HO-1表