PI3K-Akt信號通路在體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞中的表達及調控.pdf

1、目的：觀察PDKp110催化亞基及p-Akt、Akt在體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞中的表達，并對其進行調控，探討PI3K/Akt信號通路在小兒血管瘤的發(fā)生、發(fā)展及消退過程中的作用。
　　 方法：
　　 1.用組織塊結合酶消化法培養(yǎng)血管瘤內皮細胞，待長成單層細胞以后傳代，建立血管瘤血管內皮細胞系，觀察其增殖特征，繪制其生長曲線，并用第Ⅷ凝血因子相關抗原進行鑒定。
　　 2.同步化培養(yǎng)血管瘤內皮細胞，采用Western b

2、lotting檢測血管瘤內皮細胞PI3Kp110、p-Akt及Akt蛋白表達水平，同期用流式細胞儀檢測血管瘤血管內皮細胞周期的分布及凋亡率，并分析PI3Kp110、p-Akt與Akt表達水平與血管瘤血管內皮細胞周期的分布及細胞凋亡的相關性。
　　 3.待細胞處于對數(shù)生長期，換無血清培養(yǎng)液孵育48小時使細胞同步化，然后加入25μmol/LLY294002、10nmol/L雷帕霉素、1.0g/L的曲安奈德繼續(xù)孵育24小時，細胞刮刀收

3、集細胞，檢測體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞中PI3Kp110催化亞基、p-Akt及Akt的表達水平，同時檢測血管瘤內皮細胞周期分布及細胞凋亡率，并分析p110、p-Akt及Akt的表達水平與體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞周期分布及凋亡的相關性。
　　 結果：
　　 1.培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞于4-5天后并始貼壁生長，一周后只有少量細胞鋪展貼壁生長，兩周后開始分裂增殖，三周后細胞開始快速生長，四周后細胞鋪滿瓶底。用相差倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所

4、分離的內皮細胞呈上皮細胞形態(tài)，部分呈環(huán)狀排列，并有鋪路石樣外觀。培養(yǎng)細胞第Ⅷ凝血因子相關抗原表達為陽性。
　　 2.體外培養(yǎng)的血管瘤血管內皮細胞中有p110、p-Akt及Akt蛋白的表達。
　　 3.LY294002、雷帕霉素干預24小時后，p110及p-Akt蛋白表達水平較對照組下降：對照組p110(0.37±0.04)、p-Akt(0.22±0.02)；干預組LY294002 p110(0.19±0.01)、p-Ak

5、t(0.09±0.02)，雷帕霉素p110(0.15±0.00)、p-Akt(0.09±0.00)，與對照組比較，統(tǒng)計學差異均較大(P<0.01)；曲安奈德干預24小時后p110蛋白表達水平下降：p110(0.10±0.00)，與對照組比較，統(tǒng)計學差異較大(P<0.01)，而p-Akt蛋白未見表達；干預組細胞周期均阻滯于G0/G1期：對照組(60.88±6.23)％，LY294002(93.81±2.65)％、雷帕霉素(88.30±3.

6、66)％，曲安奈德(92.93±0.01)％，干預前后有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；凋亡細胞總數(shù)增加：對照組(0.51±0.03)％，LY294002(11.24±2.34)％，雷帕霉素(14.40±1.77)％，曲安奈德(9.98±0.67)％，與對照組比較，統(tǒng)計學差異較大(P<0.01)。而總Akt蛋白表達水平無變化。
　　 結論：
　　 1.體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞中有PI3Kp110、p-Akt及Akt表達。