RGD修飾的腺病毒介導LIF和IL-24雙基因共表達對人白血病細胞體內外的抑癌增效作用.pdf

1、目的：
　　構建RGD修飾的LIF和/或IL-24單、雙基因腺病毒表達載體，研究其對人白血病MEG01細胞及裸鼠移植瘤體內外的抑制作用及分子機制。
　　方法：
　　將本實驗室構建的LIF和/或IL-24重組轉移質粒與RGD修飾的腺病毒骨架質粒pAd（RGD）同源重組，經QBI-293A細胞包裝獲得RGD修飾的Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24重組腺病毒載體。在293A細胞中擴增

2、并檢測病毒的效價。感染白血病K562、MEG01細胞，熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測經RGD修飾后的腺病毒載體對白血病細胞的感染效率。體外實驗分為Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24腺病毒載體組和PBS對照組、Ad.RGD空病毒載體組。各實驗組感染MEG01細胞后，Western blot檢測目的基因LIF、IL-24的表達，通過CCK-8法檢測LIF和/或IL-24基因表達對MEG01細胞增殖的影響

3、，PE-AnexinV/7-AAD雙染后，經流式細胞儀檢測攜帶LIF和/或IL-24基因的腺病毒對MEG01細胞凋亡的影響。PI染色，流式細胞儀檢測各實驗組細胞周期的變化。Transwell法檢測LIF和/或IL-24基因表達對MEG01細胞侵襲能力的影響。Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bad、P53的表達，Real-time PCR檢測細胞周期及侵襲相關基因P21、E2F1、MMP-2/9的表達。體內

4、實驗，建立人白血病MEG01細胞裸鼠移植瘤模型，實驗組在瘤體內注射腺病毒Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24進行治療，對照組注射PBS和Ad.RGD空病毒，隔日一次，共注射5次。通過觀察并測量瘤體體積、重量，研究LIF和/或IL-24基因表達對裸鼠移植瘤的生長抑制作用。移植瘤取出后，石蠟包埋切片，免疫組化檢測相關因子Bcl-2、Bax、Caspase3、P53、E2F1的表達。
　　結果：<

5、br>　　成功構建 RGD修飾的腺病毒載體 Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。經RGD修飾后，對白血病細胞MEG01的感染效率從30％提升到90%，K562細胞的感染效率從15%提升到50%左右。Western blot證實了腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24基因能夠在MEG01細胞中成功表達，體外實驗結果表明：與 PBS組和空病毒組相比，Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.

6、RGD-LIF-IL24實驗處理組均能夠明顯抑制 MEG01細胞的增殖和誘導細胞凋亡，且Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達組對細胞抑制作用更顯著；周期結果顯示，各實驗組均能產生G2/M期阻滯作用；侵襲實驗結果表明LIF和/或IL-24單、雙基因表達均能夠抑制 MEG01細胞的侵襲轉移，且雙基因共表達的抑制作用更顯著。體內實驗，成功建立裸鼠人白血病 MEG01細胞移植瘤模型，瘤體內注射攜帶目的基因LIF和/或IL-24的腺病毒治療

7、后，移植瘤的生長受到明顯的抑制，且雙基因共表達組抑瘤作用更顯著。分子機制結果表明：Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達能夠明顯上調 Bax、P53、Caspase3、P21和下調 Bcl-xl、Bcl-2、E2F1、MMP-2/9等細胞凋亡、周期及侵襲相關基因的表達，且其效應較Ad.RGD-LIF或Ad.RGD-IL24單基因組更為顯著。
　　結論：
　　1、成功構建 RGD修飾的腺病毒載體 Ad.RGD-LIF、Ad

8、.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修飾后，能夠顯著提升腺病毒載體對 MEG01和 K562細胞的感染效率。
　　2、腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24單/雙基因表達在體外、體內均能夠顯著抑制白血病MEG01細胞的生長和誘導細胞發(fā)生凋亡，且Ad.RGD-LIF-IL24雙基因共表達組具有抑癌增效作用。
　　3、腺病毒載體攜帶LIF和/或IL-24單/雙基因在MEG01細胞中表達均能明顯上調Bax、P5