孕三烯酮微球治療大鼠子宮內膜異位癥的藥效學研究及機制探討.pdf

1、目的： 研究孕三烯酮微球在大鼠體內的長效作用和對大鼠子宮內膜異位癥的治療效果并探討孕三烯酮治療子宮內膜異位癥的機制。 方法： 1．選取動情周期規(guī)則的大鼠，單次皮下注射孕三烯酮微球后，陰道涂片，記錄動情間期持續(xù)的天數(shù)，了解藥物在大鼠體內的釋藥時間。 2．采用外科移植法建立大鼠子宮內膜異位癥模型，三周后剖腹，模型成功者隨機分為五組，分別為溶劑對照組，卵巢去勢組，孕三烯酮微球1．3mg／kg／lOd、4．Omg

2、／kg／lOd和12．Omg／kg／lOd組。給藥后20天后解剖，測量異位內膜體積，了解孕三烯酮微球對大鼠異位內膜體積的影響。 3．解剖時，腹主動脈取血，磁分離酶聯(lián)免疫測定法測度大鼠體內的雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，并取出子宮及移植異位內膜，固定、切片，免疫組化SP法測定各組動物子宮及移植異位內膜的雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達，了解孕三烯酮對大鼠E2、P及ER、PR表達的影響。 4．采用膠原酶消化，2

3、00目的尼龍篩過濾，傳代2次，體外分離、純化及培養(yǎng)內異癥患者在位子宮內膜間質細胞，建立內異癥的體外細胞模型。 5．間質細胞(F2)以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后，分別以含或不含終濃度為100nM的孕三烯酮的無血清DMEMS／F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后用基因芯片法，尋求差異表達基因，并用實時定量RT—PCR法對差異基因進行驗證，了解孕三烯酮在體外對內異癥在位子宮內膜細胞部分細胞因子表達的影響。 結果： L大鼠

4、皮下注射單劑量孕三烯酮微球3．0、6．0、12．Omg／kg后1～3天內，陰道涂片出現(xiàn)白細胞，并分別持續(xù)了12．83、14．50、16．83天，與對照組比較差異顯著(P

5、／lOd劑量組差異顯著，而微球1．3mg／kg／lOd劑量組差異不明顯。提示孕三烯酮微球L3mg／kg／10d劑量時對異位內膜無明顯抑制作用，而4．Omg／kg／10d和12．Omg／kg／10d劑量時對異位內膜有明顯的抑制作用，尤以4．Omg／kg／lOd劑量效果顯著。12．Omg／kg／10d劑量時抑制率要低于4．Omg／kg／10d劑量，但兩者差別無統(tǒng)計學意義(P=0．514)。 3．與陰性對照組比較，孕三烯酮12．Omg

6、／kg／lOd劑量能顯著降低大鼠體內的P(P<0．01)和E2水平(P<0．05)，而4．Omg／kg／10d劑量雖然亦能使體內E1、P降低，但無統(tǒng)計學意義。1．3mg／kg／10d劑量時，體內E2、P水平較對照組升高，但亦無統(tǒng)計學意義。 4．免疫組化結果顯示：職、PR在大鼠子宮腺上皮細胞、腔上皮細胞及間質細胞內均有表達，其中以腺上皮細胞表達為強。大鼠移植異位子宮內膜的ER、PR表達量均較在位子宮內膜下降(P值分別

7、O．05)。孕三烯酮4．Omg/kg／lOd和12．Omg／kg／10d劑量使大鼠在位和異位子宮內膜ER、PR表達的平均灰度顯著增高(P

8、胞生長因子一18(FGFl8)、白介素-lb(IL-lb)、白介素一2(IL一2)、血小板衍生內皮細胞生長因子B(PDGFB)、中期因子(mdkine，MK)、Neuregulin2(NRG2)、Neuropi¨n2(NRP2)共9種基因表達下調。實時定量RT一PCR驗證分析的結果和基因芯片結果一致。 結論： 雌性大鼠單劑量注射孕三烯酮微球后，動情周期連續(xù)2周受抑制，說明孕三烯酮微球能夠抑制大鼠排卵，在體內能夠維持2周的

9、時間，具有緩釋長效作用。孕三烯酮微球4．Omg／kg／10d和12．Omg／kg／10d劑量時能夠減小大鼠異位內膜的體積，抑制大鼠異位內膜的生長，對內異癥有良好的治療作用。 通過外科移植法建立的大鼠子宮內膜異位癥模型中，移植異位子宮內膜的ER、PR表達量較在位子宮內膜下降，可能與異位內膜和在位內膜的生長的外部條件不同有關。 孕三烯酮微球使大鼠體內E2、P下降明顯，但未達到去勢水平。能夠顯著降低大鼠子宮內膜及移植異位內膜上

10、皮、腺上皮及間質細胞內ER、PR的表達。孕三烯酮對內異癥的治療作用，主要通過作用于脒、PR，通過下調激素受體的表達，抑制雌孕激素與受體的結合而發(fā)揮抗雌孕激素作用。 在體外，孕三烯酮能夠下調子宮內膜間質細胞EGF、FGF4、FGFl8、PDGF2、兒一113、IL2、Midkine、Neuregulin2、Neuropilin2基因的表達。這些基因大部分已公認與內異癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關，少數(shù)基因與內異癥的關系，目前還未見報道，但