甲狀腺激素促進多發(fā)性硬化癥緩解期髓鞘再生修復的實驗研究.pdf

1、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是目前臨床最常見的一種中樞神經系統(tǒng)慢性脫髓鞘疾病，伴隨著運動、感覺、認知功能障礙等臨床癥狀反復發(fā)作和緩解。其病理改變?yōu)榉翘禺愋缘闹袠猩窠浵到y(tǒng)炎癥、脫髓鞘和軸突丟失，并隨著病程進展會形成中樞脫髓鞘斑塊。多發(fā)性硬化癥的主要臨床癥狀有行走困難、疲勞、疼痛和記憶力下降等，這些癥狀的嚴重程度與中樞脫髓鞘病變的數(shù)量和炎癥、脫髓鞘和軸突損傷、髓鞘再生修復和軸突修復的程度密切相關。
　　

2、 在經典的復發(fā)，緩解型MS病人的自然病史中，其癥狀緩解期被認為是機體髓鞘再生修復和軸突功能代償?shù)年P鍵時期，脫髓鞘的軸突會被新形成的髓鞘重新包裹，軸突功能失常也能逐漸恢復，所以多發(fā)性硬化癥的緩解期也被認為是髓鞘再生修復期。但是，原發(fā)性進展型多發(fā)性硬化癥(the primary progressive MS，PPMS)和繼發(fā)性進展型多發(fā)性硬化癥(the secondary progressive MS，SPMS)這兩種特殊類型的多發(fā)性硬化癥

3、病人，他們的緩解期并不明顯或根本不存在，PPMS和SPMS病人在第一次或第二次臨床發(fā)病后，病程進展迅速，病情發(fā)展快，很快導致嚴重的功能障礙和身體殘疾。
　　 PPMS和SPMS病人與經典的復發(fā)一緩解型MS病人最明顯的區(qū)別，就發(fā)生在緩解期。為什么PPMS和SPMS病人病程進展這么快而且預后也不好？可能就是在緩解期發(fā)生了一些阻止髓鞘再生修復和軸突功能修復的事件。所以關注緩解期，特別是關注緩解期的髓鞘再生修復可能是解決問題的關鍵之所在

4、。
　　 另一方面，腦組織具有一定的少突膠質細胞增殖分化和髓鞘再生修復的能力，但隨著MS病程的進展，這種髓鞘再生修復是不完全的，甚至是失敗的。所以經典的復發(fā)-緩解型MS雖然具有緩解期，且其破壞的髓鞘在緩解期也能得到一定程度的再生修復，但是這種髓鞘再生修復隨著病程的發(fā)展是不能完全被補償?shù)?，所以，隨著病變積累，最終會導致嚴重的功能障礙和身體殘疾。
　　 目前，對MS的主要治療策略集中在抗免疫治療或稱之為免疫調節(jié)治療方面，雖然

5、能夠有效的緩解MS復發(fā)的頻率，但在對髓鞘再生修復、神經保護及功能殘疾發(fā)展方面并沒有太大的作用。
　　 綜上所述，關注髓鞘再生修復的關鍵時期也就是MS的緩解期顯得尤為重要。如果在這個關鍵時期能夠保持足夠數(shù)量和有功能的髓鞘，或促進其再生修復，進而有效的促進神經功能保護，對MS的治療就會事半功倍。
　　 臨床研究報道，PPMS和SPMS與經典的復發(fā)一緩解型MS在甲狀腺激素(Thyroidhormone TH)水平上明顯不同：在

6、MS病人的腦脊液中，甲狀腺激素水平明顯異常，其中TT4水平明顯升高，TT4/rT3比例升高；另外，腦脊液中rT3水平、TT4/rT3比例與MS的類型也有關系。但是，甲狀腺激素水平的變化到底是疾病的原因還是結果尚不清楚。相關的MS臨床案例提示我們，甲狀腺激素可能在決定MS病人的臨床類型和進程預后方面發(fā)揮重要作用，最可能的是，甲狀腺激素通過影響髓鞘再生修復過程來影響MS病人的緩解期，導致臨床癥狀發(fā)展的不同。
　　 大量研究表明，甲狀

7、腺激素是神經系統(tǒng)發(fā)育不可缺少的激素之一，它參與神經發(fā)育和髓鞘形成的關鍵過程，嬰兒期和青春期缺乏TH會導致呆小癥(以智力障礙和身材矮小為主要臨床表現(xiàn))。動物實驗證實，在甲狀腺機能減退動物模型中，髓鞘形成延遲；在甲狀腺機能亢進動物模型中，髓鞘形成增加。甲狀腺激素是干細胞分化和轉分化、少突膠質細胞分化成熟、細胞停止分裂、終末髓鞘產生等過程中重要的影響和誘導因素。在急、慢性脫髓鞘動物模型中，給予外源性的甲狀腺激素(T3)能夠促進癥狀的緩解和髓鞘

8、再生修復。
　　 但在脫髓鞘模型中，甲狀腺激素的不足是否會對髓鞘再生修復產生影響，甲狀腺激素在髓鞘再生修復期間的重要性如何？特別是在MS的緩解期--這個髓鞘再生修復的關鍵時期，甲狀腺激素是否發(fā)揮獨特的作用？此時額外給予適量的外源性甲狀腺激素是否有利于促進機體的髓鞘再生修復和癥狀的緩解以及疾病的恢復？其具體機制是什么？目前并沒有關于這些問題的實驗研究。
　　 Cuprizone(CPZ)是一種選擇性銅離子螯合劑，具有特異性

9、誘導少突膠質細胞死亡作用，最終導致髓鞘損傷。CPZ誘導脫髓鞘動物模型是一個被廣泛用來研究脫髓鞘和髓鞘再生修復的經典模型。我們應用CPZ誘導脫髓鞘，然后通過撤除藥物模擬MS疾病的緩解期，觀察此時的髓鞘再生修復情況，簡述如下：CPZ誘導小鼠脫髓鞘模型通過喂食含0.2%CPZ的飼料6周而建立，可誘導明顯的中樞神經系統(tǒng)脫髓鞘病變，然后，改為喂食正常飼料，讓小鼠自行恢復2周，使髓鞘逐漸再生修復，模擬MS病人的緩解期。在髓鞘再生修復的2周，干預小鼠

10、的甲狀腺激素水平，通過給予含0.15% PTU的飲用水，以抑制小鼠自身的甲狀腺激素分泌；同時，另一組給予腹腔注射外源性T3，以提高小鼠血清中的甲狀腺激素水平。在此基礎上，利用免疫組化、免疫熒光、電鏡、行為學、Western Blotting等技術方法，觀察甲狀腺激素對中樞神經系統(tǒng)胼胝體區(qū)域的髓鞘再生修復和軸突保護的影響，并初步探討其細胞機制。
　　 主要的研究結果分為以下三部分：
　　 第一部分：甲狀腺激素對髓鞘再生修復

11、期間小鼠體重及運動能力的影響。
　　 1.實驗動物分組和甲狀腺激素檢測
　　 CPZ誘導脫髓鞘小鼠被分成4組，在誘導髓鞘再生的2周內，CPZ+PTU組給予含PTU飲用水抑制甲狀腺激素，CPZ+N組給予正常飲用水作為對照；CPZ+T3組給予腹腔注射T3提高甲狀腺激素，CPZ+PBS腹腔注射PBS作為對照。同時設置4組正常小鼠作為CPZ誘導脫髓鞘4組的對照，N+PTU組給予含PTU飲用水抑制甲狀腺激素，N組給予正常飲用水作為

12、對照；N+T3組給予腹腔注射T3提高甲狀腺激素，N+PBS腹腔注射PBS作為對照。在第6周末，利用LFB+MBP染色鑒定脫髓鞘模型的可靠性，發(fā)現(xiàn)CPZ誘導脫髓鞘導致小鼠胼胝體區(qū)域大量脫髓鞘改變，證實了脫髓鞘模型建立成功。
　　 第8周末，為了驗證小鼠甲狀腺激素水平的改變，用放射免疫法檢測了小鼠血清總T3和血清總T4水平，發(fā)現(xiàn)PTU能明顯抑制小鼠血清總T3/T4的水平，而腹腔注射T3能夠明顯提高小鼠血清T3水平，反饋性抑制小鼠血清

13、T4水平。證實了本實驗利用PTU和T3成功的干預了小鼠在髓鞘再生期的甲狀腺激素水平。
　　 2.小鼠體重監(jiān)測
　　 作為總體情況的監(jiān)測，每天稱重小鼠的體重改變作為最基礎和總體性的觀察。正常小鼠體重緩慢增加，在第8周體重增加了8.053±1.22g，而CPZ誘導脫髓鞘導致小鼠體重急劇下降，在前2周體重丟失4.175±0.99g，在后面4周有緩慢的恢復并趨于穩(wěn)定，在第6周末體重丟失1.495±1.24g。而撤除CPZ誘導髓鞘

14、再生修復時，同CPZ+N對照組比較，CPZ+PTU組小鼠體重明顯受到了抑制，其平均相對體重最后只能恢復0.38±1.70g(CPZ+N：3.59±1.14g)P<0.05。而CPZ+T3組的小鼠體重同CPZ+PBS組比較并沒有明顯的恢復，但是同CPZ+PTU組相比卻有明顯的恢復，其平均相對體重最后恢復2.14±1.09g P<0.05。說明甲狀腺激素對髓鞘再生修復期小鼠的總體情況具有顯著的促進恢復作用。
　　 3.小鼠協(xié)調運動能

15、力和平衡能力監(jiān)測
　　 為了評價小鼠的運動協(xié)調能力和平衡能力在髓鞘再生修復過程中的變化，我們利用旋轉棒實驗來記錄他們在高速旋轉棒上的維持時間。當撤除CPZ飼料誘導髓鞘再生修復的時候，CPZ+N和CPZ+PBS兩個對照組小鼠在旋轉棒上的時間得到明顯的恢復，其運動協(xié)調能力和平衡能力得到明顯改善，但是CPZ+PTU組小鼠在旋轉棒的表現(xiàn)卻受到了明顯抑制，其在棒上維持時間停留在84.88±10.96s(CPZ+N：105.67±20.72

16、s)P<0.05。而CPZ+T3組小鼠在棒上維持時間卻得到明顯的提升，其運動協(xié)調能力和平衡能力的到改善，其棒上維持時間恢復到120.10±14.70s(CPZ+PBS：106.13±14.38s)P<0.05。表明甲狀腺激素在髓鞘再生修復期間的不足，會明顯延緩小鼠的協(xié)調運動能力和平衡能力恢復，而提高甲狀腺激素水平，能夠促進其協(xié)調運動能力和平衡能力的明顯恢復。
　　 4.小鼠自發(fā)活動和探索習性檢測
　　 為了進一步評價小鼠

17、在新環(huán)境中的自發(fā)活動強度和探索習性，曠場實驗被用來檢測小鼠在髓鞘再生修復2周后的曠場行為學表現(xiàn)。跟CPZ+N對照組小鼠相比，CPZ+PTU組小鼠在曠場中明顯的自發(fā)活動和探索活動減少，其運動總路程只有15803.98±1241.49mm(CPZ+N：20396.96±2047.39mm)P<0.05。而CPZ+T3組小鼠在曠場中的自發(fā)活動和探索活動有輕微的提升，其運動總路程也達到了21167.86±1646.75mm(CPZ+PBS：19

18、747.35±1682.llmm)P>0.05。但是小鼠的運動習性等高級功能卻沒有受到影響，各組的中間區(qū)域運動路程比例和中間區(qū)域停留時間比例都維持在3.7%和2.4%左右。說明了小鼠自發(fā)活動強度的改變可能主要是運動能力變化而引起，而與高級功能改變可能關系不大。
　　 第二部分：甲狀腺激素對胼胝體髓鞘再生修復及少突膠質譜系細胞的影響。
　　 1.甲狀腺激素促進胼胝體髓鞘的再生修復
　　 甲狀腺激素在髓鞘再生修復期間

19、對小鼠體重和運動能力具有顯著性的促進恢復作用，為了驗證甲狀腺激素的上述作用是否是由于其對髓鞘再生修復的促進效應，本文以胼胝體區(qū)髓鞘為研究對象，用LFB組化染色和MBP免疫組化染色，Western Blotting技術驗證小鼠胼胝體區(qū)域髓鞘改變情況。發(fā)現(xiàn)同CPZ+N組相比較，CPZ+PTU組小鼠胼胝體髓鞘染色明顯稀疏，淺淡，且MBP髓鞘蛋白表達量明顯減少(P<0.01)，而CPZ+T3組同CPZ+PBS組相比，其髓鞘染色明顯增多和致密，M

20、BP髓鞘蛋白表達量明顯增加(P<0.01)。說明在髓鞘再生期間，甲狀腺激素不足明顯抑制胼胝體髓鞘再生修復，而提高甲狀腺激素水平能明顯促進胼胝體髓鞘的再生修復。
　　 2.甲狀腺激素促進胼胝體有髓軸突的數(shù)量增多
　　 為了檢測甲狀腺激素對有髓軸突以及髓鞘厚度的影響，應用電鏡技術檢測了各組胼胝體區(qū)髓鞘的改變，發(fā)現(xiàn)相比較于CPZ+N對照組，CPZ+PTU組胼胝體區(qū)域，正常髓鞘的軸突數(shù)量明顯減少(P<0.01)，裸露的軸突占主要

21、成分，其有髓軸突的髓鞘厚度并沒變薄，而CPZ+T3組，胼胝體區(qū)，正常髓鞘包裹的軸突明顯得到恢復，其裸露的軸突數(shù)量較CPZ+PBS對照組明顯減少(P<0.01)，同樣有髓軸突的髓鞘厚度并沒有增厚。說明在髓鞘再生修復過程中，甲狀腺激素的干預并沒有影響髓鞘的厚度，而是通過影響有髓軸突的數(shù)量來影響髓鞘的再生修復。
　　 3.甲狀腺激素促進少突膠質譜系細胞增殖
　　 髓鞘再生修復的不同是否與中樞髓鞘形成細胞―少突膠質細胞的改變有關

22、？為了進一步驗證胼胝體區(qū)少突膠質細胞的改變，我們用免疫熒光技術檢測各組胼胝體區(qū)少突膠質細胞各階段的改變。結果顯示CPZ+PTU組在髓鞘再生修復過程中甲狀腺激素的不足，會明顯影響少突膠質細胞的成熟階段，成熟前階段以及前體階段，導致所有階段的細胞數(shù)目明顯減少，與CPZ+N組相比較，CPZ+PTU組前體階段只有其21.3%細胞數(shù)，成熟前階段只有其76.7%細胞數(shù)，成熟階段只有其58.7%細胞數(shù)。而且在室管膜下區(qū)(SVZ)幾乎沒有前體細胞的增生

23、。但是，提高甲狀腺激素水平卻能明顯促進少突膠質譜系細胞的增生。其胼胝體區(qū)成熟、成熟前、前體三個階段的細胞數(shù)得到了明顯的促進和增生，特別是室管膜下區(qū)(SVZ)有大量的少突膠質前體細胞明顯增生。說明，在髓鞘再生過程中，甲狀腺激素的不足，會顯著抑制少突膠質譜系細胞的增殖，從而減少髓鞘的恢復；而提高甲狀腺激素的水平則能明顯促進少突膠質譜系細胞的增殖，從而促進髓鞘的再生修復。
　　 第三部分：甲狀腺激素對軸突、星形膠質細胞以及小膠質細胞的

24、影響。
　　 1.甲狀腺激素促進軸突的髓鞘包裹和生存
　　 為了檢測在髓鞘再生過程中，甲狀腺激素對軸突的影響，我們利用激光共聚焦技術和電鏡技術做了深入的觀察。發(fā)現(xiàn)相比較于CPZ+N對照組，CPZ+PTU組小鼠胼胝體區(qū)域發(fā)現(xiàn)大量NF200陽性染色多而MBP陽性染色少的并存區(qū)域，紅色的NF200染色區(qū)域表現(xiàn)為連續(xù)的，長線狀的并沿軸突走行方向延伸。這些結果提示胼胝體區(qū)域大量裸露的軸突存在。而CPZ+T3組相比較于CPZ+PBS

25、組則胼胝體區(qū)域表現(xiàn)為大量MBP陽性染色增多而NF200陽性染色減少的區(qū)域，并且NF200紅色染色不再表現(xiàn)為連續(xù)而長線狀的染色，提示甲狀腺激素能夠明顯促進髓鞘重新包裹裸露的軸突。同時，電鏡發(fā)現(xiàn)CPZ+PTU組的軸突線粒體明顯增大，其直徑幾乎是CPZ+N組的2倍，而且軸突形態(tài)較大，提示軸突的生存狀態(tài)惡化。而CPZ+T3組的軸突跟CPZ+PBS組一樣都已經回歸正常的水平，處在改善的狀態(tài)。說明，在髓鞘再生修復的過程中，甲狀腺激素能夠促進髓鞘重新

26、包裹軸突，進而改善軸突的生存狀態(tài)，促進生存，改善其功能；而甲狀腺激素的不足，明顯抑制髓鞘重新包裹軸突，導致軸突的線粒體腫大，生存狀態(tài)惡化，影響其功能。
　　 2.甲狀腺激素減少星形膠質細胞增生而對小膠質細胞并沒有明顯影響
　　 在髓鞘再生修復過程中，提高甲狀腺激素的水平能夠明顯減少胼胝體區(qū)域星型膠質細胞的增生以及促進其激活形態(tài)轉變成正常形態(tài)。而相反的，甲狀腺激素的不足，導致了胼胝體脫髓鞘區(qū)域大量星形膠質細胞增生，其細胞形

27、態(tài)也為激活狀形態(tài)。然而，甲狀腺激素的改變對胼胝體區(qū)域的小膠質細胞的改變卻沒有明顯的影響，小膠質細胞都在甲狀腺激素不足組和甲狀腺激素提高組都改變一致，沒有顯著性差異。說明甲狀腺激素還可能通過影響星形膠質細胞的增殖和激活，影響髓鞘的再生。卻對小膠質細胞的改變沒有明顯的影響。
　　 在臨床上，MS病人發(fā)作期的預防治療一直以來得到足夠的重視，但是對MS病人緩解期的治療卻是關注不夠。關注緩解期這一髓鞘再生的關鍵時期，維持和促進髓鞘再生應該

28、是治療MS的理想策略。我們的實驗研究提示在多發(fā)性硬化癥的緩解期這個重要的髓鞘再生過程中，機體的甲狀腺激素扮演了一個非常重要的角色：甲狀腺激素的不足通過減少少突膠質譜系細胞增殖分化和有髓軸突的數(shù)量、引起軸突的生存狀態(tài)惡化以及星形膠質細胞的增殖和激活，導致髓鞘再生修復受阻、運動能力和體重恢復受阻；而提高甲狀腺激素水平則能明顯的逆轉和促進上述的環(huán)節(jié)，但是甲狀腺激素對髓鞘厚度以及小膠質細胞并不產生影響。本實驗研究提供了甲狀腺激素影響髓鞘再生修復